تست MTT (سمیت سلولی)

بررسی تکثیر و بقای سلولی از تکنیک­های مهم و اساسی در آزمایشگاه­های سلولی محسوب می­شود. این بررسی نیازمند کمّی سازی دقیق تعداد سلول­های زنده در محیط کشت سلولی است. بنابراین روش­های محاسبۀ بقای سلولی جهت بهینه­ سازی شرایط کشت سلول، ارزیابی عوامل رشد سلولی، کشف آنتی­ بیوتیک­ها و داروهای ضد سرطان، ارزیابی اثرات سمّی آلاینده ­های محیطی و مطالعات آپوپتوز ضروری هستند. برای چنین اهدافی روش­های متعددی می­توانند مورد استفاده قرار گیرند اما روش­های غیرمستقیم با استفاده از نشانگرهای فلورسنت یا رنگ­زا (کروموژن)، روش­هایی بسیار سریع در مقیاس بزرگ را فراهم می ­کنند. از میان این روش­ها، سنجش بقای سلولی با تست MTT پرکاربردترین روش محسوب می­ شود. پروتکل MTT ، یک روش رنگ سنجی برای بررسی تکثیر و بقای سلول­ها است که در سال ۱۹۸۳ توسط Mossman معرفی گردید.

اساس پروتکل MTT مبتنی بر فعالیت میتوکندری می­ باشد.

فعالیت میتوکندریایی در سلول­های زنده به صورت پایدار است و بنابراین افزایش یا کاهش تعداد سلول­های زنده به صورت خطی با فعالیت میتوکندری در ارتباط می­ باشد. رنگ تترازولیموم MTT در سلول­های فعال (به لحاظ متابولیکی)، إحیا می­ شود. آنزیمهای دهیدروژناز میتوکندریایی در سلول­های زنده، حلقۀ تترازولیوم را شکسته و با تولید NADH و NADPH منجربه تشکیل رسوب نامحلول ارغوانی رنگ به نام فورمازان می­شوند. این رسوب می­تواند توسط ایزوپروپانول یا دی متیل سولفواکسید حل شود. از سوی دیگر، سلول­های مرده، چنین توانایی را نداشته و بنابراین سیگنالی را نشان نمی­ دهند. در این روش، تشکیل رنگ به عنوان نشانگر سلول­های زنده مورد استفاده قرار می ­گیرد. شدت رنگ تولید شده، در طول موج ۵۴۰ تا ۶۳۰ نانومتر اندازه­ گیری می­ شود و به طور مستقیم با تعداد سلول­های زنده متناسب است.

کاربردهای مهم تست MTT عبارتند از :

  • اندازه ­گیری تکثیر سلولی در پاسخ به عوامل رشد، سایتوکاین­ها، میتوژن­ها و مواد مغذی
  • تجزیه و تحلیل ترکیبات کشندۀ سلول یا متوقف کنندۀ رشد سلول مانند داروهای ضد سرطان، سموم، آلاینده­های محیط زیست و سایر عوامل دارویی
  • ارزیابی واسطه­ های فیزیولوژیک و آنتی­بادی­های مهار کنندۀ رشد سلولی
  • کشف دارو، غربالگری داروهای سمی و ضد سرطان
  • مطالعۀ فعالیت سلول
  • بررسی اتصالات سلولی
  • مطالعات سمیّت شیمیایی

ایمنی بالا و فراهم نمودن یک سیستم رنگ سنجی و غیر رادیواکتیو از مزایای مهم این روش محسوب می­ شوند. استفاده از کیت های تجاری بسیار راحت است، حساسیت و دقت بالایی دارد. از سوی دیگر بازدهی بالایی برای اندازه ­گیری تکثیر، بقاء و مرگ و میر سلولی دارد و روش اجرای آن نیازی به مراحل وقت گیر شستشو و انتقال از یک پلیت به پلیت دیگر را ندارد. نمونه­ های مورد بررسی در این روش عبارتند از سلول­های چسبنده یا معلق و سلول­های تکثیر شونده یا غیر تکثیر شونده.

 

پروتکل MTT

  1. سلول های مورد نظر را تا آنجا کشت داده که به تراکم یا تعداد مورد نظر برسند.
  2. سلولهای را از فلاسک جدا کرده و می شماریم.
  3. میزان مورد نیاز از سلول ها را در خانه های پلیت ۹۶ می ریزیم (seeding).
  4. ۲۴ ساعت انکوباسیون.
  5. دارو ها را می توان با دوز ها و روش های مختلف به سلول های هر خانه اضافه کرد (treatment).
  6. بسته به نوع تست، ساعات انکوباسیون با دارو می تواند ۲۴، ۴۸ و یا ۷۲ ساعت باشد.
  7. پس از انکوباسیون دارو، مایع رویی در هر خانه را خارج می کنیم.
  8. ۶۰ میکرولیتر محلول MTT به هر خانه اضافه می کنیم.
  9. پس از گذشت ۳ تا ۴ ساعت، محلول را خارج می کنیم.
  10. توسط DMSO که یک حلال قوی است، رنگ بنفش را موجود در خانه ها را حل می کنیم.
  11. با استفاده از نانودراپ و در ۵۷۰ نانومتر، جذب را خوانده و IC50 را محاسبه می کنیم.

 

لینک های مفید

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.