پلیت کشت سلول، صفحه‌ای مسطح است که تعداد مشخصی چاهک روی آن قرار دارد. هرکدام از چاهک‌ها به‌عنوان یک لوله‌آزمایش کوچک محسوب می‌شوند. تعداد چاهک‌ها باتوجه‌به نوع آزمایش و کشت سلول تعیین می‌شود. درب‌های این ظروف برای سهولت کار شماره‌گذاری شده و همچنین امکان عبور گاز از آنها وجود دارد.
پلیت کشت سلولی تبدیل به یکی از ابزارهای استاندارد در تحقیقات آنالیزی و آزمایشگاه‌های تشخیصی طبی شده است. یک استفاده‌ی بسیار متداول از پلیت‌ها در روش‌های ایمونو سوربنت (الایزا) می‌باشد که اساس اکثر آزمایش‌های تشخیصی پزشکی در انسان‌ها و حیوانات می‌باشد. این وسیله کاربردهای زیادی از جمله استفاده در آزمایشات کلونینگ و سیستم‌های آنالیز مبتنی بر کشت بافت دارد.
ویژگی‌های پلیت کشت سلولی:
- استریل و تیمار شده (جلوگیری از آلودگی سلول‌ها)
- طراحی مناسب برای نگهداری به تعداد زیاد در فضای محدود
- شفافیت مناسب و بهینه (برای مشاهده با چشم و یا میکروسکوپ)
- قابل‌استفاده در تمامی تکنیک‌های کشت سلولی از مقیاس بزرگ تا کلونینگ
- لبه برجسته به‌منظور پیشگیری از آلودگی تقاطعی بین چاهک‌های مختلف
تفاوت پلیت‌های کشت سلول در چیست و چه کاربردی دارند؟
پلیت‌های کشت سلول در تعداد 4،6،12،24،48،96 خانه و در انواع ته صاف، U شکل و V شکل بنا بر احتیاج خریداری می‌شوند.
دیگر متغیر پلیت‌های کشت سلولی رنگ و چسبندگی آنهاست که در رنگ‌های سفید، شفاف و مشکی و کف چسبنده و یا ساده به فروش می‌رسند.
تفاوت پلیت‌های ته صاف، U شکل و V شکل
- U شکل؛ ته چاه گرد است. ازآنجاکه این ظروف چاه‌هایی با هیچ لبه‌ای ندارند، مناسب تکان دادن و شستشو نمونه می‌باشند. کف U شکل برای چسبیدن سلول‌ها به هم و سایر سنجش‌هایی که به این کارها نیاز دارند استفاده می‌شود.
- V شکل؛ ته چاه مخروطی است. ریکاوری نمونه با کف V شکل بیشترین مقدار بوده و به همین دلیل صفحات با ته V مخصوصاً برای رسوب سنجی و ذخیره‌سازی مناسب هستند.
- F شکل؛ ته چاه صاف است. مناسب برای اندازه‌گیری‌های نوری دقیق، رنگ‌سنجی، کشت سلولی و همچنین کاربردهای میکروسکوپی.
ظروف کشت سلولی چسبنده و غیرچسبنده
ظروف کشت سلولی معمولاً از شیشه بوروسیلیکات یا پلاستیک‌های شفاف (معمولاً پلی‌استایرن یا پلی‌کربنات) ساخته می‌شوند که امکان مشاهده میکروسکوپی بدون اعوجاج را فراهم می‌کند. آنها اغلب دارای درپوش‌هایی هستند که تبادل مداوم گاز را در عین محافظت از محیط ارائه می‌دهند.
فرایند کشت بافت شامل قراردادن یک میکروپلیت پلی‌استایرن در معرض گاز پلاسما به‌منظور آب‌گریز کردن سطح آن می‌باشد. سطح حاصله به دلیل وجود گروه‌های عاملی حاوی اکسیژن مانند هیدروکسیل و کربوکسیل دارای بار منفی است. به‌طورکلی، این امر منجر به افزایش پیوستگی سلولی می‌شود.
پلیت PDL و PLL چیست؟
PDL مخفف Poly-D-lysine و PLL مخفف Poly-L-lysine می‌باشد. هنگامی که کف ظرف کشت سلولی با این ماده پوشیده شده باشد به علت واکنش‌های الکترواستاتیک بین غشا سلولی با بار منفی و این پلیمرها با بار مثبت سلول‌ها به کف ظرف متصل می‌شوند.
تفاوت ظروف PDL و PLL؟
PDL توسط پروتئازهای سلولی تخریب نمی‌شود. ازآنجاکه پلی لیزین یک پروتئین مصنوعی است، بر مسیرهای سیگنالینگ سلول‌ها تأثیر نمی‌گذارد و کاملاً عاری از هرگونه آلودگی حیوانی است. تقریباً همه انواع سلول‌ها به کف ظروف کشت با روکش پلی لیزین می‌چسبند.
مقایسه خصوصیات سلول‌های چسبنده و غیرچسبنده
اکثر سلول‌های مشتق از مهره‌داران به جز رده سلول‌های خونی که سوسپانسیونی یا غیرچسبنده (Suspension or Non-adherent) هستند، وابسته به اتصال به کف ظرف کشت بوده و می‌بایست روی بستر مناسبی کشت یابند تا امکان اتصال و گسترش آنها فراهم شود. بااین‌وجود، رده‌های سلولی زیادی را نیز می‌توان به کشت در حالت سوسپانسیونی عادت داد. سلول‌های کشت یافته به‌صورت سوسپانسیونی نیازی به کشت بر روی بستری با قابلیت اتصال ندارند.
سلول‌های چسبنده (Adherent) پس از رسیدن به تراکم حداکثری نیاز به افزایش بستر کشت دارند ولی سلول‌های سوسپانسیونی را می‌توان بدون افزایش بستر کشت، با ایجاد تکان‌های منظم دورانی به‌منظور تبادل گاز دی‌اکسیدکربن و البته با تزریق محیط کشت تازه رشد داد. مشخصات کشت سلول‌های چسبنده و سوسپانسیونی در جدول ذیل نشان‌داده‌شده است.
کشت سلول های چسبنده(adherent cells) | کشت سلول های سوسپانسیونی(suspension cells) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
(continuous harvesting) |
(batch harvesting) |
پروتکل پاساژ رده های سلولی چسبان
- سلول‌های داخل فلاسک را به کمک میکروسکوپ معکوس از نظـر میـزان تـراکم و عدم آلودگی باکتریایی یا قارچی بررسی کنید. درصورتی‌که آلودگی مشاهده نشـد و میزان تراکم سلول‌ها به حد مناسبی رسیده بود می‌توان سلول‌ها را پاساژ داد.
- محیط کشت رویی سلول‌ها را به طور کامل تخلیه کنید.
- لایه سلولی را با بافر فسفات فاقد یون‌های کلسیم و منیـزیم کـه بـه دمـای محـیط رسیده است شستشو دهید. برای شستشوی سلول‌ها از نصـف حجـم محـیط کشـت برداشته شده استفاده کنید. درصورتی‌که سلول‌ها چسبندگی شـدیدی بـه فلاسـک داشته باشند مرحله شستشو را یک‌بار دیگر تکرار کنید.
- برای آزادسازی سلول‌ها، از محلول تریپسین / EDTA اسـتفاده کنیـد. ایـن محلـول حاوی 25 درصد تریپسین و 0.02 درصد EDTA می‌باشد که در بـافر هـنکس فاقد کلسیم و منیزیم حل شده است. بدین منظور به‌ازای هر 25 سانتی‌متر مربـع از کف فلاسک یک میلی‌لیتر از محلـول تریپسـین EDTA به فلاسـک اضـافه کنیـد. فلاسک را به طور افقی تکان دهید تا محلـول تریپسـین تمـام سلول‌ها را در برگیرد محلول تریپسین بایستی در حجم‌های کـم تقسـیم شـده و در فریـزر -20درجـه سانتیگراد نگهداری شود. توجه کنید که منجمد و ذوب کردن مکرر این محلـول، به‌شدت از فعالیت آنزیمی آن می‌کاهد.
- فلاسک را به انکوباتور بر گردانید و به مدت 2 تا 10 دقیقه صبر کنید تا آنـزیم روی مولکول‌های چسبندگی اثر کند.
- فلاسک را از انکوباتور خارج نموده و به‌آرامی چند بار با کف دست بـه کناره‌های آن ضربه وارد کنید تا سلول‌های باقی‌مانده آزاد شوند. فلاسـک را بـا میکروسـکوپ معکوس بررسی کنید تا از آزاد شدن تمام سلول‌ها مطمئن شوید.
- به سوسپانسیون سلولی داخل فلاسک مقدار 5 تا 10 میلی‌لیتر محـیط کشـت حـاوی سرم اضافه کنید تا پروتئین‌های موجود در سرم باعث غیرفعال‌شدن تریپسین شود. برای اطمینان از غیرفعال‌شدن و حذف تریپسین می‌توان سلول‌ها را سـانتریفیوژ نموده و مایع رویی را دور ریخت و رسوب سلولی را در مقدار کمی از محـیط کشـت تازه به حالت سوسپانسیون درآورد.
- مقدار 100 تا 200 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی را برداشـته و شـمارش سـلولی انجام دهید تا تعداد سلول‌ها در هر میلی‌لیتر محیط کشت به دست آید.
- مقدار مناسبی از سلول‌ها را برداشته و به فلاسک جدیدی که از قبل به آن برچسب زده‌اید اضافه کنید. معمولاً تعداد سلول لازم برای پاسـاژ دادن هـر تیـره سـلولی در برگ ضمیمه آن نوشته شده است. تعداد این سلول‌ها به خصوصیات رشـد، سـرعت تقسیم سلولی و اندازه سلول‌ها بستگی دارد.
- فلاسک‌ها را در انکوباتوری با دما و رطوبت مناسب قرار دهید.
- باتوجه‌به سرعت رشد سلول‌ها هرچند روز یک‌بار پاساژ را تکرار کنید
گاهی گیرنده‌ها و پروتئین‌های سطح سلولی در کار تحقیقاتی ما اهمیـت دارنـد. به طور مثـال زمانی که قرار است پروتئین‌های سطحی سلول را بررسی کنیم، بخصـوص هنگـامی کـه می‌خواهیم این پروتئین‌ها را با آنتی‌بادی‌های اختصاصی رنگ‌آمیزی کنـیم اسـتفاده از پروتئازهـا مناسب نیست. در این موارد، افزودن پروتئازها باعث آسیب مولکول‌های سطحی موردنظر ما شده و سلول‌ها را تا چند ساعت غیرقابل‌استفاده می‌نماید. در چنـین مـواردی بـا کمـک روش‌های مکانیکی نظیر ضربه‌زدن به فلاسک یا جمع‌کردن لایه سلولی به‌وسیله اسـکراپر می‌توان سلول‌ها را از فلاسک آزاد نمود.
پست های مرتبط
خرید مواد مصرفی ( شامل پلیت کشت سلولی و … )
Share It