جداسازی و خالص سازی اسید نوکلئیک : آماده سازی نمونه نوکلئیک اسید شامل طیف وسیعی از تکنیک ها برای تبدیل نمونه ای است که نمی تواند مستقیماً با الزامات تکنیک تحلیلی مورد استفاده قرار گیرد مانند رونویسی معکوس (RT-PCR یاPCR) جداسازی و خالص سازی اسید نوکلئیک و ارزیابی کیفیت، گامهای مهمی در گردش کار آزمایشی است زیرا کیفیت اسیدهای نوکلئیک می تواند بر عملکرد واکنشهای پایین دستی تأثیر بگذارد. روشهای معمول خالص سازی اسید نوکلئیک و همچنین روشهای شناسایی در بخشهای زیر بحث شده است.

جداسازی RNA

هنگام کار با سلول ها یا بافت ها به عنوان ماده شروع ، اولین مرحله از فرآیند جداسازی و خالص سازی اسید نوکلئیک، لیز سلولی یا نفوذپذیری غشاء است. این فرایند باعث شکسته شدن غشاهای سلولی می شود و ساختار سلولی را مختل می کند تا لیز سلول ایجاد شود. این امر به اسید نوکلئیک مورد نظر امکان دسترسی و جدا شدن از اجزای سلولی ناخواسته را می دهد. لیز سلولی را می توان با تکنیک های مکانیکی به دست آورد ، یا با یک بافر لیز می توان شیمیایی انجام داد. بافرهای لیز برای پارگی سلول ها توسط اسمز طراحی شده اند و ترکیبات آنها برای برنامه های خاص قابل تنظیم است. بافر لیز به طور معمول حاوی مواد شوینده مانند NP-40 یا Triton است تا لیپیدهای غشایی را مختل کند. عوامل چلاتی مانند EDTA و EGTA نیز ممکن است در مهارکننده لیز حضور داشته باشند تا فعالیت نوکلئاز را مهار کنند. پروتئیناتی مانند پروتئیناز K همچنین می تواند برای تسهیل لیز سلولی مورد استفاده قرار گیرد. لیز سلول حاصل از آن می تواند در معرض جدایی فیزیکی مانند سانتریفیوژ ، جداسازی شیمیایی مانند استخراج فنل / کلروفرم یا جداسازی مبتنی بر فاز جامد مانند یک ستون برای جداسازی اسید نوکلئیک مورد نظر قرار گیرد.

تخلیص با فیلتر ستونی می تواند برای خالص سازی RNA از کشت سلولی پستانداران، باکتریها و مخمرها و همچنین بافتهای گیاهی و حیوانی استفاده شود. با تنظیم pH و نمک محلول، RNA را می توان با جذب بر روی غشای سیلیس واقع در پایه ستون فیلتر از باقی مانده های سلولی یا سایر آلاینده ها جدا کرد. این روش جداسازی محبوب RNA با پروتکل های خلاء و سانتریفیوژ سازگار است. به طور معمول ، مولکول های RNA> 200 جفت باز به غشا جذب می شوند. پس از اتصال RNA به غشاء، برای از بین بردن آلودگی هایی مانند DNA، پروتئین ها و چربی ها در معرض یک شستشوی شدید قرار می گیرند. هضم با DNase اختیاری می تواند برای به حداقل رساندن آلودگی DNA ژنومی باقیمانده انجام شود. هنگام تهیه نمونه های RNA برای RT-qPCR ، تیمار با DNase ممکن است لازم باشد برای جلوگیری از تقویت احتمالی هر گونه DNA ژنومی، که می تواند منجر به تعداد کپی از mRNA شود. RNA خالص شده سپس با یک بافر شستشو درون یک لوله جمع آوری شسته می شود. حجم بافر شستشو مورد استفاده برای شستشو با توجه به غلظت نهایی RNA مورد نظر تغییر می کند. به عنوان مثال ، می توان حجم کمتری از بافر شستشو برای به دست آوردن غلظت بالاتر از RNA استفاده کرد. RNA جدا شده با استفاده از فیلتر ستونی برای استفاده در انواع برنامه های پایین دستی از جمله RT-PCR ، PCR و آنالیز بلات مناسب است. تغییرات روش تخلیص با فیلتر ستونی همچنین می تواند برای جداسازی RNA های کوچک مانند میکرو RNA ها استفاده شود.

جداسازی DNA

از تخلیص با فیلتر ستونی می توان برای خالص سازی DNA از کشت سلولی پستانداران ، باکتریها و مخمرها و همچنین بافتهای گیاهی و جانوری استفاده کرد. با تنظیم pH و نمک محلول ، DNA مورد نظر را می توان با اتصال DNA به غشای سیلیس واقع در انتهای ستون فیلتر ، از بقایای سلولی یا سایر آلاینده های ناخواسته جدا کرد. این یک روش محبوب برای تصفیه DNA ژنومی و پلاسمیدی است. پروتکل های خلاء و سانتریفیوژ در دسترس هستند. پس از اتصال DNA به غشاء ، برای از بین بردن آلودگی هایی مانند RNA ، پروتئین ها و لیپیدها در معرض یک شستشوی شدید و شدید قرار می گیرند. DNA خالص شده با یک بافر شستشو به درون یک لوله جمع آوری از غشایی خارج می شود. حجم بافر شستشو مورد استفاده بسته به غلظت نهایی پلاسمید یا DNA مورد نظر می تواند متغیر باشد. DNA کشف شده برای استفاده با روش PCR و آنالیز بلات مناسب است. به طور سنتی، از شیب کلرید سزیم برای خالص سازی DNA پلاسمید به دور از DNA ژنومی استفاده شد. در حالی که این روش DNA بسیار خالص را در اختیار شما قرار می دهد ، بسیار زمان بر است و نیاز به حذف اتییدیم برومید و کلرید سزیم از پلاسمید دارد. کیت های تخلیص پلاسمید وسیله ای سریعتر و کارآمدتر برای تخلیص با جفت بازهای DNA> 200 فراهم می کند. DNA بر روی غشای مستقر در سیلیس جذب می شود و RNA ، پروتئین و سایر اجزای سلولی شسته می شوند. DNA خالص شده با استفاده از بافر شستشو شسته شده و به شکلی که بلافاصله برای توالی فلورسنت ، انتقال به سلول ، الکتروپوریشن و اصلاح آنزیمی در دسترس است ، بهبود می یابد. کیت های تصفیه پلاسمید برای استفاده از انواع نمونه های مختلف موجود است.

DNA Fragment Cleanup

الکتروفورز ژل یک روش مؤثر برای جداسازی مولکولهای DNA بر اساس وزن مولکولی آنها است. میزان سوپرکویلینگ یا تراکم DNA نیز بر نحوه انتقال یک مولکول DNA از طریق ژل تأثیر می گذارد. مولکول های DNA کوچکتر و کم حجم تر با سرعت بیشتری در ماتریس ژل حرکت می کنند در حالی که مولکول های بزرگتر یا کم فشرده تر آهسته تر حرکت می کنند. به این ترتیب، می توان مولکول های DNA با اندازه های مختلف را روی ژل جدا کرد. پس از جدا شدن ، یک باند DNA مورد نظر می تواند از ژل آگارز خارج شده و از طریق فیلتراسیون در قالب spin-column تخلیص شود. این امر به بازیابی DNA در طیف گسترده ای از اندازه قطعات (۵۰ جفت باز تا ۲۳ کیلو جفت باز) می دهد. از DNA بهبود یافته می توان برای PCR ، پیوندها ، برچسب زدن یا سایر واکنشهای آنزیمی بدون خالص سازی بیشتر یا تهیه نمونه استفاده کرد.

خصوصیات نمونه اسید نوکلئیک

دانستن غلظت ، خلوص و یکپارچگی یک نمونه اسید نوکلئیک اغلب برای کاربردهای پایین دستی مهم است. اسپکتروفتومتری و الکتروفورز ژل ابزارهای متداولی هستند که می توان از آنها برای اندازه گیری و ارزیابی این خصوصیات استفاده کرد.

غلظت

قانون بیر-لمبرت اجازه می دهد تا غلظت اسیدهای نوکلئیک در یک نمونه بر اساس میزان نور جذب شده در ۲۶۰ نانومتر محاسبه شود:

A = εbc

که در آن A جذب (به عنوان چگالی نوری نیز شناخته می شود) ، ε ضریب خاموشی، b طول مسیر cuvette نمونه، و c غلظت ترکیب در یک محلول است.

خلوص

اسپکتروفتومتری همچنین می تواند برای برآورد خلوص یک نمونه اسید نوکلئیک اسید مورد استفاده قرار گیرد. آلاینده های شناخته شده مانند پروتئین و حلال های آلی، نور را در طول موج های مختلف جذب می کنند. بنابراین ، از نسبت جذب می توان برای تخمین خلوص نمونه استفاده کرد. از آنجا که پروتئین ها نور را با سرعت ۲۸۰ نانومتر جذب می کنند، از نسبت ۲۶۰ نانومتر به ۲۸۰ نانومتر به منظور برآورد میزان آلودگی پروتئین در یک نمونه اسید نوکلئیک استفاده می شود.

برای DNA خالص ۲۶۰ نانومتر / ۲۸۰ نانومتر = ۱٫۸ ~
برایRNA خالص۲۶۰ نانومتر / ۲۸۰ نانومتر= ~ ۲٫۰

آلودگی هایی مانند فنل و سایر ترکیبات آلی با سرعت ۲۳۰ نانومتر جذب می شوند. بنابراین ، ارزیابی دیگر از خلوص اسید نوکلئیک ، میزان جذب ۲۶۰ نانومتر در ۲۳۰ نانومتر است. برای DNA خالص ۲۶۰ نانومتر / ۲۳۰ نانومتر = ۱٫۸ ~

برایRNA خالص ۲۶۰ نانومتر / ۲۸۰ نانومتر= ~ ۲٫۰

یکپارچگی

تمامیت یک نمونه اسید نوکلئیک را می توان با استفاده از ژل الکتروفورز تجزیه و تحلیل کرد. نمونه مورد نظر معمولاً برای از بین بردن ساختار ثانویه آن روی ژل دناتوره کننده لود می شود. برای RNA خالص ، دو باند باید در ژل، مربوط به RNA ریبوزومی ۱۸S و ۲۸S ظاهر شوند. اگر یک اسمیر به جای دو باند دیده شود، این نشان می دهد که RNA در نمونه تخریب شده است. ابزارهای میکروسیال در دسترس تجاری اکنون از مقدار نسبتاً کمی از نمونه ورودی برای تعیین غلظت اسید نوکلئیک ، خلوص و یکپارچگی استفاده می کنند.