رنگ آمیزی گرم یک تکنیک رنگ‌آمیزی ضروری در آزمایشگاه میکروبیولوژی است. این روش از نام باکتری‌شناس دانمارکی به نام هانس کریستین گرام گرفته شده است که برای اولین‌بار آن را در سال 1882 معرفی کرد و برای شناسایی ارگانیسم های ایجاد کننده ذات الریه به کارگرفت. رنگ‌آمیزی گرم امروزه یکی از روش هایی است که برای تشخیص وجود عفونت باکتریایی مورداستفاده قرار میگیرد و نتیجه آن نشان می دهد که آیا عفونت شما از باکتری گرم مثبت است یا گرم منفی. همچنین ممکن است از رنگ‌آمیزی گرم برای تشخیص عفونت قارچی استفاده شود.
رنگ آمیزی گرم برای بیماران مشکوک به مننژیت و دیگر بیماری‌ها با عامل میکروبی گونه‌های استافیلوکوک، استرپتوکوک، باسیل‌ها شامل گونه‌های Corynebacterium، Clostridium، Clostridioides و گونه‌های لیستریا مورداستفاده قرار میگیرد. رنگ‌آمیزی به روش گرم، سریع، ارزان و نسبتاً قابل‌اعتماد است (دقت این روش حدود 50٪ تا 90٪) و نتیجه آن در درمان و تجویز داروی ضد میکروبی مورد اسفاده قرار میگیرد.
نمونه ای از یک باکتری گرم منفی، اشریشیا کلی (یا E. coli) است که یکی از علل شایع عفونت‌های دستگاه ادراری است. قارچ‌ها (به شکل مخمرها یا کپک‌ها) نیز ممکن است در ابتدا با رنگ‌آمیزی گرم شناسایی شوند، که در ادامه به نحوه رنگ‌آمیزی قارچ‌ها به روش گرم نیز اشاره می‌کنیم، اما ویروس‌ها با رنگ‌آمیزی گرم قابل مشاهده نیستند.
به طور کلی هر میکروارگانیسم فاقد دیواره سلولی با روش گرم رنگ‌آمیزی نمی‌شوند و در برابر آنتی بیوتیک هایی که سنتز دیواره سلولی را هدف قرار می‌دهند، مقاوم هستند. باکتریهای جنس مایکوپلاسما فاقد دیواره سلولی در اطراف غشای سلولی خود هستند، به این معنی که با روش گرم رنگ‌آمیزی نمی‌شوند.
پپتیدوگلیکان (PG) عامل اصلی رنگ‌آمیزی در روش گرم میباشد. پپتیدوگلیکان، همچنین بنام مورئین یا موکوپپتید شناخته میشود، هترو پلیمری متشکل از قندها و آمینو اسیدها میباشد که تشکیل دهنده دیواره سلولی باکتری‌ها است. پپتیدوگلیکان حاوی یک قند منحصربه‌فرد به نام ان استید مورامیک اسید است.
قبل از آغاز رنگ‌آمیزی، ابتدا باید یک لایه اسمیر از محیط کشت خالص باکتری بر روی لام تهیّه کنیم.
ابتدا رنگ کریستال ویوله رابه مدت 30 تا 45 ثانیه بر روی اسمیر باکتری روی لام می‌ریزیم و درنتیجه همه باکتری‌ها به رنگ بنفش درخواهد آمد. اما به راحتی قابل شستشو و رنگ بری میباشد زیرا این رنگ دارای اندازه مولکولی کوچکی است و بین لایه پپتیدوگلیکان دیواره سلولی به راحتی جا به جا میشود و برای پایداری آن نیاز به یک ماده شیمیایی دیگر میباشد که اندازه آن را افزایش دهد. پس از شستشو رنگ اضافی با آب از روی لام، لوگول را برای ثبیت به مدت 30 تا 45 ثانیه روی لام می‌ریزیم (نه به صورت ممتد بلکه چند قطره که فضای لام را در بربگیرد و چکه نداشته باشد). لوگل با کریستال ویوله ترکیب شده و ایجاد کمپلکس‌هایی نامحلول می‌نماید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله در داخل دیواره سلولی باکتری میشود. پس از این مرحله، همه باکتری‌ها کماکان به رنگ بنفش مشاهده می‌شوند.
پس از تثبیت رنگ با لوگل، که سبب پایداری رنگ در دیواره ظخیم باکتری های گرم مثبت میشود، با شستشوی لام با آب، لام را به مدت 15 تا 20 ثانیه در معرض مواد رنگ زدا مانند الکل استون قرار داده و سپس با آب لام را شستشو میدهیم. در باکتریهای گرم منفی که دارای لایه‌های پپتیدوگلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه‌ها وغشا می‌گردد و باکتری رنگ مراحل قبل را از دست می‌دهد، ولی در باکتریهای گرم مثبت به علت ضخامت زیاد لایه ی پپتیدوگلیکانی وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی‌شود. در نتیجه پس از این مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ، ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند. در نهایت سطح لام را با سافرانین یا فوشین (قرمز رنگ( به مدت 30 تا 45 ثانیه می‌پوشانیم. سپس با آب شستشو داده و پس از خشک شدن با میکروسکوپ مورد بررسی قرار میدهیم. دراین مرحله باکتریهای بی رنگ )باکتری های گرم منفی) به رنگ قرمز درمی‌آیند و باکتریهای گرم مثبت بدون تغییر، بنفش، باقی میمانند.
به طور خلاصه رنگ زدایی با حلال ها انجام میشود که شامل الکل استون و برای شستشو آب میباشد.
در رنگ آمیزی گرم باکتری‌ها، تقریباً تمام میکروارگانیسم‌ها به دو گروه متمایز، گرم مثبت و گرم منفی، تقسیم می‌شوند. این نوع تقسیم‌بندی بر اساس تفاوت در دیواره سلولی باکتری‌هاست. در این روش، رنگ اصلی یعنی رنگ پایه کریستال ویوله با گروه‌های بار منفی موجود در دیواره سلولی واکنش می‌کند. بعد از آن که رنگ اضافی آن با آب شسته میشود، سلول‌ها در معرض محلول پتاسیم ید (به نامید گرم) قرار می‌گیرند. ید با کریستال ویوله تشکیل کمپلکس غیرمحلول ویوله – ید را می‌دهد که کریستال ویوله به‌شدت به دیواره سلولی باکتری‌ها اتصال می‌یابد. سپس، سلول‌ها را با الکل شسته تا کمپلکس ویوله – ید از سلول خارج گردد. سلول‌های گرم منفی به‌سرعت به علت افزودن الکل، رنگ خود را از دست می‌دهند، درصورتی‌که، سلول‌های گرم مثبت به بی‌رنگ شدن مقاوم هستند. بعد، رنگ اضافی با شستن آب خارج می‌گردد. سپس سلول‌ها را با رنگ دیگری به نام سافرانین که فقط سلول‌های گرم منفی رنگ می‌گیرند، رنگ‌آمیزی می‌کنند. در این روش رنگ‌آمیزی، سلول‌های گرم مثبت به رنگ آبی – بنفش و سلول‌های گرم منفی به رنگ صورتی – قرمز مشاهده می‌شوند.
۱- اسمیر نازکی از کشت باکتریهای مورد نظر تهیه کنید و معرف‌ها را به صورت زیر اضافه کنید.
۲- محلول کریستال ویوله را روی اسمیر بریزید و یک دقیقه صبر کنید.
۳- لام را به مدت ۵ ثانیه با آب شستشو دهید.
۴- پتاسیم ید را روی اسمیر ریخته و یک دقیقه صبر کنید.
۵- لام را به مدت ۵ ثانیه با آب شستشو دهید.
۶- الکل اتیلیک را به مدت ۵ ثانیه به آرامی روی آن بریزید.
۷- لام را به مدت ۵ ثانیه با آب شستشو دهید.
۸- سافرانین را روی لام بریزید و ۳۰ ثانیه صبر کنید.
۹- لام را به مدت ۵ ثانیه با آب شستشو دهید.
۱۰- صبر کنید تا لام در هوا خشک شود.
۱۱- سپس بر روی آن لامل قرار داده و با کمک روغن سدر با عدسی ×۱۰۰ آن را در زیر میکروسکوپ نوری مشاهده کنید.
Share It