سیستم کلونینگ Gateway ، از اواخر دهه ۱۹۹۰ توسط Invitrogen اختراع و تجاری شده است، یک روش مولکولی است که محققان را قادر می سازد با استفاده از یک مجموعه اختصاصی از توالی های نوترکیب، سایت های “Gateway att” و دو آنزیم اختصاصی به نام “LR Clonase ” ، و “BP Clonase”، قطعات DNA را توسط پلاسمیدها منتقل کنند. تکنیک کلونینگ Gateway اجازه می دهد ضمن حفظ قالب خواندن، قطعات DNA را بین وکتورهای مختلف کلونینگ منتقل کند. با استفاده از Gateway می توان بخشهای DNA ساب کلون را برای تجزیه و تحلیل عملکردی کلون نمود. این سیستم نیاز به درج اولیه یک قطعه DNA در پلاسمید با دو توالی نوترکیب به نام “att L 1” و “Att L 2” دارد، تا بتواند یک کلون ورودی Gateway Entry (نامگذاری ویژه Invitrogen) ایجاد کند.

بایگانی های بزرگی از کلون های ورودی Gateway Entry ، حاوی اکثریت قریب به اتفاق ORF های انسانی، موش و رت از کتابخانه های cDNA انسانی کلون شده اند یاسنتز شیمیایی با استفاده از بودجه NIH (مؤسسات ملی بهداشت) (مانند ، مجموعه ژن های پستانداران ، http://mgc.nci.nih.gov/) می باشد. در دسترس بودن این کاست های ژنی در پلاسمید کلونینگ استاندارد Gateway به محققان کمک می کند تا به سرعت این کاست ها را به پلاسمیدها منتقل کنند که تجزیه و تحلیل عملکرد ژن را تسهیل می کند. کلونینگ Gateway برای تنظیم اولیه زمان بیشتری می برد و گران تر از آنزیم های محدود کننده سنتی و روش های کلونینگ مبتنی بر لیگاز است ، اما باعث صرفه جویی در وقت می شود و کلونینگ ساده تر و بسیار کارآمد را برای برنامه های پایین دست ارائه می دهد.

این فناوری بویژه برای برنامه هایی که نیاز به انتقال هزاران قطعه DNA به یک نوع پلاسمید دارند (به عنوان مثال ، حاوی یک پروموتر CMV برای بیان پروتئین در سلول های پستانداران) یا انتقال یک قطعه DNA در انواع مختلف پلاسمیدها (به عنوان مثال ، بیان پروتئین باکتریایی ، حشرات و پستانداران) به کار گرفته می شود.

ویژگی های سیستم کلونینگ Gateway

راندمان کلونینگ ۹۵٪ برای کلون مورد نیاز شما را تحویل می دهد
چهارچوب جهت گیری و خواندن را در کل مراحل کلون سازی حفظ می کند
کلون کردن کارآمد قطعات تک به صورت همزمان در وکتورهای مختلف
انعطاف پذیری برای کلون کردن چندین ژن در یک ساختار واحد
وارد کردن از طریق وکتورهای کلونینگ Invitrogen TOPO که حاوی سایت های Gateway هستند و یا خرید یک Clone Thermo Scientific Ultimate ORF Clone که قبلاً در یک وکتور Gateway درج شده است
پیشرفت های جدید مانند MultiSite Gateway Technology باعث می شود تا کلون سازی Gateway روش کلون سازی ایده آل برای بیان پروتئین و آنالیز عملکردی باشد.

اولین قدم در کلون سازی Gateway تهیه کلون ورودی Gateway Entry است. کلون های ورودی اغلب در دو مرحله ساخته می شوند:

۱) توالی های “Gateway attB1 ، و attB2” به ترتیب با استفاده از آغازگرهای PCR مخصوص ژن و تقویت PCR به ترتیب به انتهای ۵ و ۳ “یک قطعه ژن اضافه می شوند.

۲) محصولات تقویت PCR سپس با پلاسمیدهای ویژه ای به نام Gateway “vesors donor” (نامگذاری Invitrogen) و مخلوط آنزیم اختصاصی “BP Clonase” مخلوط می شوند. مخلوط آنزیم نوترکیب و درج فراورده PCR حاوی توالی Att-B را در سایتهای نوترکیب ATP در بردار Donate Gateway انجام می دهد. هنگامی که کاست بخشی از پلاسمید هدف است ، در نامگذاری دروازه “یک کلون ورودی” نامیده می شود ، و دنباله های نوترکیبی به عنوان “att L” نوع دروازه گفته می شود.

سپس کاست ژن موجود در کلون Gateway Entry به سادگی و کارآمد می تواند با استفاده از: مخلوط اختصاصی آنزیم ، “LR کلوناز”. هزاران پلاسمید Gateway Destination ساخته شده و به طور آزاد در بین محققان در سراسر جهان به اشتراک گذاشته شده است. بردارهای Gateway Destination مشابه بردارهای بیان کلاسیک است که حاوی چندین سایت کلونینگ است ، قبل از درج یک ژن مورد علاقه ، با استفاده از هضم آنزیم محدود و بستن. بردارهای Gateway Destination بصورت تجاری از Invitrogen ، EMD (Novagen) و Covalys در دسترس هستند.

از آنجا که کلونینگ Gateway از توالی های نوترکیب ثبت شده ثبت شده ، و مخلوط های آنزیمی اختصاصی فقط از Invitrogen در دسترس است ، این فناوری به محققان اجازه نمی دهد که فروشندگان را تغییر دهند و در تأثیر قفل همه این مراحل ثبت شده کمک می کند.

برای خلاصه کردن مراحل مختلف در کلونینگ گیتوی:

واکنش B Gateway BP: PCR- محصول دارای سایتهای بطن چپ (در این مرحله می تواند از روشهای دیگر جداسازی DNA مانند محدود کردن-هضم) نیز استفاده کند. ژن مورد علاقه طرفین
واکنش Gateway LR: کلون ورودی حاوی سایت های Att L + بردار مقصد حاوی سایت های R R و پروموترها و برچسب ها + LR clonase => کلون بیان که حاوی سایت های B B ، ژن مورد علاقه طرفین ، آماده بیان ژن است.