پیش از این مطلب با پروتکل پاساژ رده های سلولی آشنا شدید. در این مطلب سعی داریم نکات علمی و کاربردی که به احتمال زیاد در هنگام پاساژ رده های سلولی در فضای آزمایشگاه کشت سلولی با آن رو به رو می شوید را به شما آموزش دهیم:
نکات کلیدی
۱- بعضی از سلول ها هنگام رشد و تکثیر سلولی اتصال ضعیفی بـه فلاسـک دارنـد و بـا تکان دادن فلاسک از کف آن جدا شده و در محیط کشت شناور می شوند. در مورد چنین سلول هایی باید قبل از خارج کردن محیط کشت فلاسک را از نظر سلول هـای شناور بررسی نمود تا سلول های آزاد شده از دست نروند.
۲- هر چند اغلب سلول ها در حضور تریپسـین مـی تواننـد از فلاسـک آزاد شـوند، امـا افزودن EDTAباعث افزایش فعالیت آنزیم شده و موجب صـرفه جـویی در میـزان مصرف آنزیم و کاهش مدت قرارگیری سلول ها در معرض آنزیم شـده و از آسـیب احتمالی آنزیم روی سلول ها جلوگیری می کند.
۳- سرم باعث غیر فعال شدن تریپسین مـی شـود. لـذا حتمـاً بایسـتی قبـل از افـزودن تریپسین، لایه سلولی را با بافر فسفات فاقد کلسـیم و منیـزیم شستشـو داد تـا سـرم موجود در محیط کشت از محیط عمل حذف شود.
۴- سلول ها فقط باید تا زمان آزاد شدن از فلاسک در معـرض تریپسـین قـرار گیرنـد. افزایش زمان قرارگیری در معرض ایـن آنـزیم باعـث صـدمه دیـدن گیرنـده هـا و مولکول های سطحی سلول می شود.
۵- باید قبل از افزودن مجدد سلول ها به فلاسک، تریپسین توسط سرم غیر فعـال شـود. فعال ماندن سرم از چسبیدن سلول ها به فلاسک جلوگیری می کند.
۶- برای غیر فعال کردن تریپسین می توان بجای سرم از پروتئین مهار کننـده تریپسـین سویا استفاده نمود. بدین منظور محلول یک میلی گـرم در میلـی لیتـر مهـار کننـده تریپسین سویا به صورت هم حجم به سلول های تریپسینه شده اضافه نمـوده سـپس سلول ها را سانتریفیوژ نموده و مایع رویی را دور ریخته و رسوب سـلولی را در حجـم مناسبی از محیط کشت تازه به صورت سوسپانسیون درآورید. اسـتفاده از ایـن مهـار کننده در رابطه با کشت های فاقد سرم اهمیت خاصی دارد.
Share It