واکنش PCR: ده نکته که هیچ کس به شما نمی گوید- قسمت دوم

۶ -غلظت DNA الگو

قبل از انجام PCR ، باید از خود بپرسید، در طول PCR چه مشکلی ممکن است ایجاد شود؟

• اتصال غیر اختصاصی
• پرایمر-دایمر
• عدم تکثیر

اگر هیچ تکثیری حاصل نشود، این یک مشکل متفاوت است ، ما بعداً در مورد آن بحث خواهیم کرد. اتصال غیر اختصاصی و پرایمر-دایمر در واقع یک مشکل واقعی است که باعث منطقه تکثیر PCR را مشخث می کند.غلظت این الگو همچنین نقش اساسی در تقویت کارآمد DNA دارد. اگر غلظت DNA خیلی زیاد باشد ، اتصالات غیر اختصاصی را تسهیل می کند.

Template DNA	Concentration	Purity
For 25 μl reaction	۳۰ to 50 ng	~۱٫۷۷- ۱٫۸۸
For 50 μl reaction	۵۰ to 100 ng	~۱٫۷۷- ۱٫۸۸

من همیشه ترجیح می دهم از DNA 30ng در واکنش ۲۵ میکرولیتر استفاده کنم و برای واکنش PCR من کاملاً خوب عمل می کند. در واقع ، غلظت پایین تر از این می تواند DNA را به طور مناسب تقویت کند.

۷ – دمای annealing واکنش

اینکه محصول نهایی چیست یا چگونه نتایج شما روی ژل ظاهر می شود، کاملاً به دمای annealing واکنش بستگی دارد. دمای آنیلینگ دمایی است که در آن آغازگر به توالی مکمل آن در DNA ما متصل می شود و مخصوص آغازگر است. بنابراین اگر دمای آنیلینگ را به خطر بیاندازید، یک مشکل بزرگ در تکثیر شما ایجاد می کند و باور کنید ، حتی نمی توانید آن را برطرف کنید. اگر دمای annealing شما خیلی کم باشد، تعداد زیادی باند در ژل دریافت خواهید کرد. اگر خیلی زیاد باشد هیچ تقویتی مشاهده نخواهد شد. من به شما پیشنهاد می کنم برای بدست آوردن دمای دقیق annealing، یک روش سنجش گرادیان PCR انجام دهید. با این وجود، می توانید با اضافه کردن ترکیباتی مانند MgCl2 و DMSO ، دمای annealing خود را فریب دهید اما به سطح بالایی از تخصص نیاز دارد. مقداری MgCl2 می تواند DNA را حتی در دمای annealing بالاتر تا ۲ درجه سانتیگراد تقویت کند. اما PCR را فریب ندهید، در عوض، از روش گرادیان استفاده کنید و دمای آنیل PCR خود را تعیین کنید. برای اطلاعات بیشتر در مورد دمای annealing، این مقاله را بخوانید: دستورالعمل طراحی پرایمر PCR.

۸- غلظت MgCl2

MgCl2 یکی از محور های اصلی واکنش PCR است. این ماده فعالیت DNA پلیمراز را تقویت می کند. هر آنزیم برای انجام یک واکنش آنزیمی به یک یون فلزی به عنوان یک کوفاکتور احتیاج دارد. یون های Mg2 + از نمک MgCl2 به جایگاه فعال DNA پلیمراز متصل می شوند و آن را فعال می کنند. بنابراین در واکنش به MgCl2 اضافی نیاز دارید. اگرچه ، سازنده قبلاً آن را در بافر Taq یا مستقیم در Taq داده است ، این بستگی به سازنده دارد. حتی برخی از شرکت ها بافر خود را برای احیای DNA پلیمراز که حاوی MgCl2 است، فراهم می کنند. از طرف دیگر، اگر ما از یکMastermix آماده استفاده می کنیم ، باید حاوی MgCl2 باشد. قبل از استفاده از هر معرف راهنمای تولید را بخوانید. اگر MgCl2 در هیچ یک از معرفها ارائه نشده است، ازآن با غلظت MgCl2: 1.0mM تا ۲٫۰ mM (بسته به شرایط مورد نیاز تا ۵mM) استفاده کنید. به یاد داشته باشید ، اگر غلظت Mg2 + در واکنش خیلی زیاد باشد، باندهای غیر اختصاصی ظاهر می شوند. بنابراین همیشه قبل از ادامه کار آن را بهینه کنید.

۹ – تعداد چرخه PCR

هیچ کس آن را سفارشی نمی کند ، و همه به طور پیش فرض از ۳۰ یا ۳۵ چرخه استفاده می کنند. اما در بعضی موارد، یا تقریباً در همه موارد استاندارد PCR می توانیم بگوییم که نیازی به استفاده از PCR برای ۳۵ چرخه نیست، و فقط نیرو و زمان بیشتری را مصرف می کند.علاوه بر این، با استفاده از چرخه های بیشتر PCR ، شانس اتصال غیر اختصاصی به همراه دیمرهای آغازگر افزایش می یابد. میپرسید چرا؟ از آنجا که پس از یک دوره زمانی خاص، به دلیل عدم وجود dNTPs ، Taq DNA پلیمراز ، DNA الگو یا هر معرف دیگر، تکثیر متوقف می شود، اما دایمر ها برای تکثیر وجود دارند و همچنان ادامه دارد. و این یک مشکل ایجاد می کند. پس چرا PCR خودمان را خراب کنیم. در عوض ، تعداد کمتری از چرخه های PCR از ۲۲ تا ۲۵ استفاده کنید. اگر تقویت کمتری رخ داد ، به شما اطلاع می دهد که در PCR بعدی چند چرخه را افزایش دهید و این کاملا معتبر است.هر مرحله در چرخه PCR باید بطور کامل انجام شود تا عملکرد واکنش به حداکثر برسد. تعداد چرخه ها در real-time PCR کمی اهمیت زیادی دارند.

۱۰ -سایر ابزار

آنچه که تاکنون در مورد آن صحبت کرده ایم ، کاری بسیار مهم است که هنگام انجام واکنش PCR انجام شود. اما سایر برنامه های کاربردی ما در PCR نیز مورد استفاده قرار می دهیم. لوله های PCR ، لوله های Eppendorf و نکاتی که در هنگام آماده سازی واکنش استفاده می شوند نقش موثری دارند. مواد پلاستیکی مورد استفاده در طول آماده سازی واکنش باید فاقد نوکلئاز باشد. نوکلئاز DNA را به قطعات کوچکتر کاهش می دهد. بنابراین مطمئن شوید که تیپ ها و لوله های PCR باید بدون نوکلئاز باشند.علاوه بر این، باید استریل باشد. اگر نه ، قبل از انجام PCR آنرا اتوکلاو کنید زیرا اگر حاوی برخی از DNA های خارجی باشد ، ممکن است تقویت شود و نتایج را خراب کند. برخی دیگر از آلاینده ها مانند اثری از مواد شیمیایی دیگر ممکن است مانع سنتز DNA شوند، بنابراین ، لازم است قبل از آماده سازی واکنش PCR ، تمام ابزاررا تمیز نگه دارید.

آخرین و مهمترین نکات برای یک تکثیرعالی

واکنش PCR را روی یخ آماده کنید
استفاده از یخ از مدتها قبل برای دانشمند مورد بحث است.برخی می گویند بدون یخ خوب است. اما من می خواهم توصیه کنم که هنگام تهیه واکنش PCR از یخ استفاده کنید (اگر از یک پلیمراز Taq DNA معمولی استفاده می کنید). پلیمراز Taq DNA به طور فعال در سنتز DNA حتی در دمای پایین نیز دخیل است. بنابراین ، هنگامی که شما واکنش را آماده می کنید، درون لوله PCR ، آنزیم Taq تکثیر هر چیزی که مکمل آغازگرها باشد ، شروع می کند. این یک دلیل اصلی برای آغازگر و اتصال غیر اختصاصی در PCR است. اگرچه ویژگی به دست آمده زیاد است ، اما دیمرهای آغازگر هنوز به همین دلیل در نتایج ظاهر می شوند. اگر این مورد با شماست ، سعی کنید واکنش روی یخ را انجام دهید.یااز Taq DNA پلیمرازhot start استفاده کنید. ما قبلاً در دو مقاله درباره DNA پلیمراز hot start و PCR hot start بحث کرده بودیم. اینجا را بخوانید
PCR hot start چیست؟
انتخاب DNA پلیمراز مناسب برای آزمایش PCR
حال ، بگذارید واکنش PCR را آماده کنیم.در این بخش ، آماده سازی واکنش PCR را به شکل فرضی انجام میدهیم:

آماده سازی واکنش PCR

در این بخش برای شما توضیح خواهیم داد که چگونه می توانید اجزای مختلفی را در واکنش PCR اضافه کنید و در هنگام تهیه واکنش چه کارهایی باید انجام دهید. در همان مرحله اول دستکش بپوشید، یک کت آزمایشگاهی، یک ماسک دهان و کلاه سر. تمام معرفها را از یخچال بردارید و روی یخ بگذارید.
در مرحله بعد ، تمام لوله های PCR را به درستی برچسب زده و معرف ها را ذوب کنید. بعد از آن در همان مرحله اول ، master mix حاوی تمام dNTP ها را در انتهای لوله اضافه کنید.
پس از آن DNA الگو را در انتهای لوله اضافه کنید. پس از افزودن DNA الگو ، بافر واکنش PCR را به لوله PCR اضافه کنید.
حالا هر دو پرایمر را در کنار لوله اضافه کنید. پرایمرها را به طور مستقیم در قسمت انتهایی لوله اضافه نکنید زیرا می تواند دیمرهای آغازگر را با اتصال به یکدیگر ایجاد کنید. به یاد داشته باشید که هر دو آغازگر را با یکدیگر مخلوط نکنید.
در مرحله پنجم ، Taq DNA پلیمرازرا به واکنش اضافه کنید. در مرحله آخر پلیمراز اضافه می شود تا زودتر واکنش ندهد.
سرانجام ، در مرحله آخر و ششم ، آب بدون نوکلئاز را به واکنش اضافه کنید. واکنش PCR ما اکنون آماده است. تمام لوله ها را اسپین کنید و بلافاصله آنرا داخل دستگاه PCR قرار دهید.

Component	Requirement
dNTPs	۵۰mM each
Forward primer	۱۰pM
Reverse primer	۱۰pM
Ta DNA polymerase	۱ unit
Template DNA	۳۰ng
Nuclease-free water	As per requirement
PCR reaction buffer (optional)	۱X
MgCl2 (optional)	۲mM

این منابع خارجی شامل کلیه اطلاعات مربوط به پروتکل های PCR ، آماده سازی واکنش PCR و پروتکل های PCR است:
فناوری PCR
پروتکل های PCR

نتیجه:

مرحله آماده سازی واکنش PCR کلید موفقیت در PCR است و PCR موفق گام اساسی در برنامه های پایین دستی مانند توالی یابی DNA و هیبریداسیون است. بنابراین ، واکنش PCR باید کاملاً درست انجام شود. غلظت هر یک از اجزای مورد استفاده در PCR یکی از مهمترین عواملی است که نتایج شما به آن وابسته است.