تکنولوژی کریسپر – کس 9 (CRISPR-Cas9) روش ساده و دقیقی برای ویرایش ژنی است که کاربردهای فراوانی در اختیار ما قرار داده است. همان طور که از نام آن مشخص می باشد Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (تناوب‌هایِ کوتاهِ پالیندرومِ فاصله‌دارِ منظمِ خوشه‌ای)

منشأ وجود کریسپر

منشأ این فناوری در اصل یک سیستم دفاعی و ایمنی پروکاریوتی در باکتری‌ها بر علیه ویروس‌ها می‌باشد. در باکتری این سازوکار دفاعی، از طریق DNA ضبط شده از ویروس‌هایی که قبلاً به باکتری یا اجداد آن حمله کرده بودند و توالی ویروس‌ها در ژنوم باکتری ثبت شده، صورت می‌گیرد. زمانی که دوباره ویروس به باکتری حمله کند. DNA ویروس توسط باکتری شناسایی شده و مولکول RNA راهنما با توالی مشخص ویروسی رونویسی شده سپس با پروتئینی به نام کس 9 (Cas9)کمپلکسی ایجاد می‌شود که به ژنوم ویروس مهاجم حمله می‌کند و توالی مکمل RNA به توالی ویروس چسبیده و پروتئین CAS9 این قطعه را برش می‌دهد و ویروس متلاشی می‌شود.

مکانیسم عمل کریسپر

یک پروتئین برش DNA به نام Cas9 و یک مولکول RNA که به‌عنوان RNA راهنما شناخته می‌شود این دو باهم یک کمپلکسی را تشکیل می‌دهند که می‌تواند بخش‌هایی از DNA را شناسایی و برش دهد. ابتدا Cas9باید یک دنباله در ژن هدف با نام PAM را شناسایی کرده و به آن متصل شود به‌محض اتصال RNA راهنما، ساختار مارپیچ دوتایی DNA را از هم باز می‌کند. )رشته RNA طوری طراحی شده تا با یک دنباله بخصوص در DNA جفت شود. ) زمانی که RNA دنباله صحیح را پیدا کند، Cas9 آن بخش از DNA را برش می‌دهد، به‌شرط آن که توالی فاصله دهنده RNA، همسانی کافی با DNA هدف داشته باشد. سلول سعی در ترمیم این قسمت می‌کند اما فرایند تعمیری همراه با خطا خواهد بود و اغلب دارای جهش‌های ناخواسته می‌باشد که موجب بلااستفاده شدن ژن می‌گردد و این موضوع باعث می‌شود که CRISPR یک ابزار عالی برای غیرفعال‌کردن ژن‌های به‌خصوص باشد اما قیچی کردن رشته دوتایی تنها کاری نیست که CRISPR می‌تواند انجام دهد. برخی از محققان بخش های برش Cas9 را غیرفعال کرده‌اند و آنزیم‌های جدید را به درون این پروتئین وارد ساختند آنگاه از Cas9 می‌توان برای منتقل کردن آن آنزیم‌ها به یک دنباله بخصوص از DNA استفاده کرد.

نتیجه نهایی برش DNA توسط Cas9 یک شکست دو رشته‌ای (DSB)است که توسط دو مسیر تعمیر می‌شودکه به شرح زیر است:

مسیر اتصال انتهایی غیر همولوگ اما مستعد خطا (NHEJ).
مسیر تعمیر هدایت‌شده همولوگ بادقت بالاتر (HDR)

مسیر تعمیر NHEJ فعال‌ترین مکانیسم ترمیم است و اغلب باعث درج یا حذف نوکلئوتیدی کوچک (indels) در محل DSB می‌شود. تصادفی بودن تعمیر DSB باواسطه NHEJ پیامدهای عملی مهمی دارد، زیرا جمعیت سلول‌هایی که Cas9 و RNA راهنما را بیان می‌کنند، منجربه مجموعه‌ای از جهش‌ها می‌شود. در بیشتر موارد، NHEJ باعث ایجاد خطاهای کوچک در DNA هدف شده که موجب حذف یا جهش می‌شود.

کمپلکس CAS9 و RNA راهنما

توالی PAM به‌عنوان یک سیگنال اتصال برای Cas9 عمل می‌کند، اما توالی دقیق بستگی به آنزیم Cas مورداستفاده دارد. پس از بیان، پروتئین Cas9 و gRNA یک کمپلکس ریبونوکلئوپروتئین را از طریق بر همکنش بین داربست gRNA و شیارهای دارای بار مثبت در سطح Cas9 تشکیل می‌دهند. Cas9 با اتصال به gRNA دچار تغییر ساختاری می‌شود که مولکول را از یک ترکیب غیرفعال و غیرمتصل به DNA به یک ترکیب فعال متصل به DNA تغییر می‌دهد.

CRISPR نوع2

دراین نوع CRISPR ، سه جزء Cas9 ، crRNA و tracrRNA موردنیاز است. این سیستم به ابزاری پرکاربرد برای ویرایش ژنوم تبدیل شده است. بر اساس سیستم CRISPR نوع ۲ که در بالا توضیح داده شد، محققین با ترکیب trRNA و crRNA به‌صورت یک RNAی راهنمای سنتز شده‌ی مصنوعی sgRNA (single guide RNA)، یک سیستم دوجزئی ساده تولید کردند. در این سیستم ساده، Cas9 توسط یک sgRNA به ناحیه‌ی موردنظر هدایت و منجر به تغییرات هدفمند ژنوم می‌شود.

انواع مختلف Cas 9

تا به امروز، سه نوع مختلف از نوکلئاز Cas9 در پروتکل‌های ویرایش ژنوم، مورداستفاده قرار گرفته است:

۱- نوع طبیعی Cas 9

نوع طبیعی Cas9 (Wild-type Cas9 nuclease) که می‌تواند به طور اختصاصی DNA را به‌صورت دو رشته‌ای برش بزند و در نتیجه منجر به فعال‌سازی ماشین‌های ترمیم دورشته‌ای (DSBs) داخل سلولی شود. در صورت عدم وجود الگوی ترمیم همولوگ، ترمیم از مسیر اتصال انتهای غیرهمولوگ (NHEJ) پیش می‌رود و در نتیجه‌ی ورود و یا حذف بازها (Indels) در محل موردنظر، منجر به اختلال در توالی هدف می‌شود. از طرف دیگر، با فراهم‌کردن یک الگوی ترمیم همولوگ و بهره‌مندی از مسیر ترمیم هومولوگی (HDR)، می‌توان جهش‌های دقیقی را در محل موردنظر، از طریق خارج کردن (Knock-out) و یا واردکردن (knock-in) یک توالی خاص انجام داد.

۲- نوع جهش‌یافته‌ی Cas 9

فرم جهش‌یافته‌ی Cas9 (Mutated Cas9 یا nickase Cas9:nCas9) که می‌تواند یک شکاف تک‌رشته‌ای (Single-strand nick) در محل موردنظر ایجاد کند؛ بنابراین مسیر ترمیم NHEJ فعال نشده و احتمال جهش‌های Indel کاهش می‌یابد. به‌منظور برش دورشته‌ای و ترمیم HDR، باید با طراحی دو sgRNA ،دو شکاف مجاور در محل موردنظر ایجاد کرد.

۳- نوع بدون فعالیت نوکلئازی Cas 9

فرم Cas9 بدون فعالیت نوکلئازی (Nuclease-deficient Cas9: dCas9) که با موتاسیون در دومین‌های نوکلئازی آن قادر به برش DNA نیست، اما هنوز می‌تواند با هدایت sgRNA به محل موردنظر متصل شود؛ بنابراین دومین‌های عمل‌کننده‌ی مختلف (فعال‌کننده‌های رونویسی، سرکوب‌کننده‌ها و پروتئین‌های فلورسنت) را می‌توان با اتصال به dCas9 به محل موردنظر هدایت کرد.

کاربردهای و شروط استفاده

هنگامی که DNA هدف توسط کمپلکس، یافت شد، Cas9 به DNA متصل می‌شود و آن را قطع و ژن موردنظر خاموش می شود. با استفاده از نسخه‌های اصلاح شده Cas9، محققان می‌توانند بیان ژن را به‌جای مکانیسم برش DNA به کار ببرند. این تکنیک‌ها به محققان اجازه می‌دهد تا عملکرد ژن را مطالعه کنند و درجهت خدمت به بشریت به کار ببرند.

می‌توان از روش CRISPR برای تولید و حذف سلول‌های ناکارآمد با بیان همزمان یک اندونوکلئاز (مانند Cas9 و Cas12a) و یک gRNA (rnaراهنما) خاص برای ژن موردنظر استفاده کرد. هدف ژنومی باید دارای حدودا 20توالی نوکلئوتیدی باشد،اما مشروط به دو شرط زیر:

توالی در مقایسه با بقیه ژنوم منحصربه‌فرد باشد.
هدف باید بلافاصله در مجاورت یک موتیف به نام Protospacer PAM قرار گیرد.

روش عملی و کلی کریسپر

برای انجام تکنیک کریسپر در آزمایشگاه روش‌های مختلفی وجود دارد اما می‌خواهیم روش کلی آن را در ادامه بررسی کنیم. در ویرایش ژنی به روش کریسپر ابتدا باید هدف خود را مشخص کنید و باتوجه‌به آن مواد موردنیاز برای این تکنیک را آماده یا طراحی کنید. همان‌طور هم که در ابتدای بلاگ توضیح دادیم تکنیک کریسپر نیازمند RNA راهنما، آنزیم Cas9 می‌باشد.

1) یک پلاسمید با ویژگی‌های موردنظر خود انتخاب سپس پلاسمید را با کمک کیت‌های استخراج پلاسمید از باکتری استخراج نمایید.

به طور مثال می‌توانید پلاسمید GFP را که یک پلاسمید بیانی است و با کمک آن می‌توان پروسه ترنسفکشن را بررسی کرد از باکتری E.coli استخراج کنید.

2) پلاسمیدهای استخراج شده را باید به سلول‌های نمونه موجود ثانویه (سلول‌های بنیادی) اضافه نمایید.

3) باتوجه‌به توالی موردنظری که می‌خواهید در DNA نمونه ثانویه تغییر دهید، RNAراهنما خود را طراحی کنید. این توالی باید در حدود 20 جفت باز باشد. قبل از طراحی gRNA، ناحیه‌ی ژنومی موردنظر را که قصد دارید ویرایش کنید، تعیین توالی نمایید زیرا تفاوت توالی بین gRNA و DNA هدف ممکن است منجر به کاهش کارایی ویرایش ژنوم شود. تعداد آلل‌های مربوط به هر ژن بسته به نوع سلول یا ارگانیسم خاص ممکن است متفاوت باشد.

4) آنزیم Cas9 به‌عنوان قیچی ژنی باید دارای توالی PAM باشد که برای اتصال به DNA موجود ثانویه لازم است.

توجه داشته باشید که می توانید RNAراهنما و Cas9 را طراحی و به حلقه پلاسمید القا کرد و یا بسته به هدف خود از انواع ساده تر آن ها استفاده کنید.

5) در مرحله بعدی در آزمایشگاه به‌دوراز هرگونه آلودگی، تمام مواردی که ذکر شد را مخلوط کرده و به کمک جریان الکتریکی، پلاسمیدها را به درون سلول‌ها کلون کنید.

6) مخلوط را در پلیت‌های کشت سلول گسترش می‌دهیم تا کلونی‌ها رشد کنند. سپس زیر میکروسکوپ کلونی‌ها را بررسی و آن‌هایی که نتایج مطلوب‌تری دارند، به پلیت‌های چاهک دار منتقل کرده تا رشد پیداکنند.

7) برای مشاهده نتایج باید DNA سلول‌ها را استخراج سپس DNA را با روش PCR گسترش دهید که به‌سادگی می‌توان این کار را با کیت‌های طراحی شده در کمترین زمان و بدون آلودگی انجام داد. بعد از پروسه PCR باید مخلوط PCR را در دستگاه الکتروفورز ران کنید تا نتایج پایانی قابل‌بررسی باشد. همچنین می‌توانید مخلوط پایانی را توالی‌یابی و به طور دقیق ترانسفکشن را بررسی کرد.

روش انجام عملی کریسپر از زبان شما

با پاسخ در مورد هریک از پرسش‌های زیر در بخش کامنت‌ها علاوه بر دریافت کد تخفیف، از ایده‌های دیگران نیز بهره‌مند شوید.

به کمک روش کریسپر به دنبال ویرایش کدام ژن هستید؟ به طور مختصر علت را بیان کنید.
به کمک کدام آنزیم جهش نقطه‌ای در یک ژن امکان‌پذیر است؟
تابه‌حال در کدام حیوان آزمایشگاهی به مطالعه افزایش و کاهش بیان ژن به کمک روش کریسپر پرداخته‌اید؟
آیا تاکنون به روش کریسپر اقدام به ژن نوترکیب کرده‌اید؟
پلاسمید موردعلاقه شما در روش کریسپرکدام است؟