استخراج DNA از خون کامل

پروتکل های بسیار متفاوتی و نیز کیت های متعددی برای استخراج DNA از خون کامل وجود دارد.روش ذکر شده در ادامه یکی از روش های معمول ارزان و قابل تکرار در مطالعات پژوهشی و بالینی است. این روش برای استخراج DNA از سلول های کشت بافتی یا بافت های جداسازی شده نیز کاربرد دارد.

مواد و روش تهیه ی محلول های ذخیره:

در این روش از معرف های شیمیایی استاندارد استفاده می شود.

1 – بن ماری یا آبگرم 65 درجه

2 – تیوب های سانتریفیوژ(فالکون 15ml)

3 – تیوب های (1/5ml) میکروفیوژ

4 – روتاتور / رولر لوله

5 – پیپت پاستور شیشه ای ، می بایست برای برداشت DNA از قبل با حرارت سر پیپت پاستور، به شکل حلقه یا قلاب درآورده شود.

6 – EDTA (نیم مولار) با PH هشت: 146/1 گرم EDTA بدون آب را به 100 میلی لیتر آب مقطر اضافه کنید ، با اضافه کردن NaOH جامد (در حدود 20 گرم)، PH آن را در سطح 8 تنظیم کنید.حجم نهایی را به 1 لیتر برسانید و به مدت 5 دقیقه در 15 پاسکال اتوکلاو کنید.

7 – Tris-HCl (یک مولار) با PH7/6: به اندازه 121/1 گرم باز Tris را در 800 میلی لیتر آب مقطر حل کنید.PH آن را با HCl تنظیم کنید(حدود 60 میلی لیتر). احتیاط:اضافه کردن اسید حرارت زا است. قبل از تنظیم نهایی pH ،اجازه دهید مخلوط تا حرارت اتاق سرد شود. حجم نهایی را با آب مقطر به 1 لیتر برسانید و به مدت 15 دقیقه در 15 پاسکال اتوکلاو کنید.

8 – معرفA: لیز سلول قرمز خون : (Tris-HCl(0/01M با 7/4 PH ، ساکارز 320mM، تریتون 100-X یک درصد

9 – 10 میلی لیتر از Tris (ا مولار) ، ساکارز 109/54mM ،به مقدار 0/47 گرم از MgCl₂ ، تریتون 100-Xیک درصد 10 میلی لیتر، PH را تا سطح 8 تنظیم کنید.حجم نهایی را با آب مقطر به 1 میلی لیتر برسانید و به مدت 10 دقیقه در 10 پاسکال اتوکلاو کنید.

10 – معرف B : لیز سلول: (Tris-HCl(0/4 M ، سدیم کلرید(NaCl) صد و پنجاه mM، سدیم دو دسیل سولفات یک درصد ، (EDTA (0/06M، از Tris (یک مولار ) 400 میلی لیتر با PH 7/6 ، از EDTA(نیم مولار) 120 میلی لیتر با 8PH ، به مقدار 8/76 گرم از NaCl بردارید و pH آن را تا سطح 8 تنظیم کنید. حجم نهایی را با آب مقطر به 1 لیتر برسانید و به مدت 15 دقیقه در 15 پاسکال اتوکلاو کنید. بعد از اتوکلاو 10 گرم سدیم دودسیل سولفات اضافه کنید.

11 – سدیم پرکلرات (5M) : به مقدرا 70 گرم سدیم پرکلرات را با 80 میلی لیتر آب مقطر حل کنید و حجم آن را به 100 میلی لیتر برسانید.

12 – بافر TE با 7/6PH : به اندازه 10 میلی لیتر از Tris-HCl(یک مولار) با 7/6pH، از EDTA(نیم مولار) 2 میلی لیتر بردارید و با آب مقطر به حجم 1 لیتر برسانید. PH را تا سطح 7/6 تنظیم کنید و به مدت 15 دقیقه در 15 پاسکال اتوکلاو کنید.

13 – کلروفرم را تا 4 درجه سانتی گراد سرد کنید.

14 – اتانول (100%) را تا 4 درجه سانتی گراد سرد کنید.

روش خون گیری:

خون را با هپارین مخلوط کنید در حرارت اتاق نگهداری کنید و در همان روز DNA را از آن استخراج کنید.

ستخراج DNA:

برای استخراج DNA از سلول های کشت یا بافت های جداسازی شده ، نیاز به مراحل 1 تا 3 نیست.

1 – 3 میلی لیتر خون کامل را در یک لوله ی فالکون 15 میلی لیتر بریزید.

2 – 12 میلی لیتر از معرف A را اضافه کنید.

3 – مخلوط خون را به مدت 4 دقیقه در حرارت اتاق با میکسر مخلوط کنید.

4 – به مدت 5 دقیقه در حرارت اتاق در دور 3000 سانتریفیوژ کنید.

5 – بدون خراب شدن رسوب سلول ها، محلول رویی را دور بریزید . رطوبت اضافی را با سر و ته کردن لوله و برگردان کردن آن بر روی دستمال کاغذی بگیرید.

6 – 1 میلی لیتر از معرف B را اضافه کنید و با ورتکس رسوب، دوباره آن را به حالت سوسپانسیون درآورید.

7 – 250μL از سدیم پرکلرات 5M را اضافه کنید و با چندین بار سر و ته کردن لوله فالکون آن را مخلوط کنید.

8 – لوله را به مدت 15 تا 20 دقیقه در حرارت 65 درجه حمام آب گرم قرار دهید.

9 – بگذارید محلول تا دمای اتاق سرد شود.

10 – 2 میلی لیتر کلروفرم سرده شده با یخ اضافه کنید.

11 – به مدت 30 تا 36 دقیقه با Rotating Mixer مخلوط کنید.

12 – به مدت 2 دقیقه در 2400 سانتریفیوژ کنید.

13 – فاز بالایی را ا کمک پیپت استریل به یک لوله ی فالکون تمیز منتقل کنید.

14 – 2 تا 3 میلی لیتر اتانول(سرد شده با یخ) اضافه کنید. لوله را باه آرامی کج کرده تا DNA رسوب کند.

15 – با استفاده از پیپت پاستور سر خمیده ، DNA را جمع کنید.

16 – DNA را به لوله اپندرف 1/5ml انتقال دهید و اجازه دهید اتانول تبخیر شود.

17 – DNA را در 200μL بافر TE به حالت سوسپانسیون درآورید.

برای واکنش PCR به طور معمول نیاز به 1μL محلول است. در این روش انتظار می رود که بین 200 تا 500 ng/μL DNA به دست آید.

منبع : www.gozareshkar.com

 

لینک های مفید

• دانلود پروتوکل فارسی و انگلیسی
• مطالعه بیشتر