DNA پلیمراز مناسب برای PCR

انتخاب DNA پلیمراز مناسب برای PCR موفقیت آمیز به دو مؤلفه مهم ، یک بافر واکنش بهینه و یک پلیمراز DNA با تحمل حرارت بالا و با کیفیت بالا (مانند Taq DNA پلیمراز) بستگی دارد. چهار ویژگی اساسی DNA پلیمراز می تواند به شما در تعیین بهترین آنزیم برای نیازهای تحقیقاتی خاص شما کمک کند:

۱٫ پایداری حرارتی. یک مرحله دناتوراسیون در حدود ۹۵ درجه سانتیگراد در هر چرخه PCR ، دو رشته یک مولکول DNA را از هم جدا می کند. DNA پلیمراز باید به اندازه کافی محکم باشد که چرخه های دمای بالا را تحمل کند بدون اینکه فعالیتی را به خطر بیاندازد ،عاملی که وابسته به ترکیب بافر و pH است.
۲٫ نرخ پیشروی آنزیم. مربوط به سرعتی است که نوکلئوتیدها در هر ثانیه به ازای هر مولکول DNA پلیمراز اضافه می شوند، عاملی که با افزایش دما ، توالی الگوی DNA و ترکیب بافر تعیین می شود. پلیمرازهای اولیه سرعت ۱ کیلوباز در دقیقه را در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد به نمایش گذاشتند، اما آنزیم های جدید به طور کلی سریعتر هستند (تقریباً ۴ کیلوبایت در دقیقه).
۳٫دقت آنزیم. خاصیتی برای DNA پلیمراز است که فرکانس درج نوکلئوتید نادرست در هر کیلوبایت DNA را تعریف می کند. برای پلیمرازهای استاندارد، وفاداری به توانایی تمایز نوکلئوتید صحیح در مقابل اختلاط نوکلئوتید نادرست اشاره دارد و می تواند تحت تأثیر ترکیب بافر باشد. پلیمرازهای با استحکام بالا به دلیل توانایی “تصحیح” و خارج کردن نوکلئوتید های نادرست، دقیق تر هستند ، و آنها را با باز صحیح جایگزین می کنند.

۴- پردازش. احتمال اینکه یک پلیمراز در طول گسترش از DNA جدا شود ، نشان می دهد که تعداد متوسط نوکلئوتیدها که آنزیم در یک رویداد اتصال مجزا اضافه می کند، به عنوان پردازش آن شناخته می شود. مانند نرخ پیشروی آنزیم، پردازش به ترکیب بافر (غلظت نمک) و توالی یک الگوی DNA بستگی دارد.این ویژگی هنگام تقویت امپلیکن های طولانی مهم است.

پیکربندی های مختلف از این چهار متغیر کلاس های مختلفی از DNA پلیمراز تولید کرده است، این پلیمرازها برای PCR معمول مانند تشخیص محصول تقویت شده و تخمین اندازه محصول مناسب هستند:

– پلیمرازهای DNA استاندارد: قطعاتی را با استفاده از باز A اضافه در انتهای ۳ تولید می کند، این امکان را می دهد تا مستقیماً وارد انتهای چسبنده کلونینگ T / A شود. پلیمرازهای DNA جدید Taq دارای پردازش خوب و سرعت توسعه سریع هستند اما فاقد قابلیت تصحیح هستند و بنابراین نمی توان برای تقویت قطعات برای کلون سازی و بیان و یا برای مطالعات جهش زایی مورد استفاده قرار گرفت.
– پلیمراز های Hot-start (HS)  پلیمرازهای DNA شروع گرم برای سرکوب تقویت غیر اختصاصی محصول در شروع PCR برای افزایش عملکرد محصول مورد نظر استفاده می شود. این بدان دلیل است که Taq استاندارد حتی می تواند در یخ (۴ درجه سانتیگراد) فعال باشد. هنگامی که اجزای واکنش مخلوط می شوند، آغازگرها می توانند به طور غیر اختصاصی به یکدیگر یا DNA الگو متصل شوند. Taq می تواند آن آغازگرهای خاص آنیل نشده را گسترش دهد و در نتیجه باعث تجمع محصولات غیر اختصاصی و کاهش بازده شود. اما با استفاده از PCR با شروع گرم، DNA پلیمراز با اصلاح شیمیایی یا آنتی بادی که هنگام افزایش دما غیرفعال و جدا می شود، غیرفعال می شود. این امر تا حد زیادی شروع غیر اختصاصی و شکل گیری پرایمر دایمر را کاهش می دهد و عملکرد محصول را افزایش می دهد. شروع مقرون به صرفه زمانی مفید است که مقادیر الگوی DNA کم باشد ، الگوهای DNA بسیار پیچیده هستند یا از چندین جفت آغازگر استفاده می شود ، همانطور که در PCR وجود دارد. آنزیم های جدید تر hot-start همچنین دارای پردازش خوب و سرعت گسترش سریع هستند، اما فاقد توانایی تصحیح نسخه هستند و بنابراین نمی توانند قطعات DNA را برای کلون یا بیان بعدی یا برای مطالعات جهش زایی تقویت کنند.

– پلیمراز های High-fidelity پلیمرازهای DNA تصحیح کننده دارای فعالیت اگزونوکلئاز ۳ به ۵ و از بین بردن باز های نادرست هنگام اتصال در رشته DNA در حال رشد است. این باعث افزایش دقت در سنتز DNA از DNA الگو، و در نتیجه نسخه ای بهتر از DNA می شود. برای کلونینگ و بیان محصول تقویت شده، مطالعات جهش زایی و کاربردهای مرتبط، باید از آنزیم های تصحیح کننده استفاده شود. اما توصیه می شود: پلیمرازهای Hi-Fi همچنین فعالیت اندونوکلئاز دارند که باعث می شود که A-overhang در ۳ انتها حذف شود، بنابراین قطعات PCR تکثیر شده نیاز به کلونینگ Blunt دارند. این پلیمرازها همچنین سرعت و پردازش کمتری دارند. پردازش را می توان با اضافه کردن یک دامنه اتصال به DNA با میل بالا افزایش داد که به لنگر پلیمراز کمک می کند و از تفکیک اولیه جلوگیری می کند. با این حال ، این پلیمرازها نسبتاً گران هستند.

– پلیمراز برای تقویت آمپلیکونهای طولانی تقویت آمپلیکون های طولانی نیاز به ترکیب فرآیند پلیمرازهای DNA استاندارد با دقت یک پلیمراز تصحیح کننده دارد که با مخلوط کردن پلیمراز مقاوم به حرارت به همراه آنزیم تصحیح کننده به دست می آید. افزودن بافر بهینه شده، معمولاً با غلظت بالای نمک ، منجر به تولید PCR با عملکرد بالا از DNA ژنومی و آمپلیکون ها به اندازه ۲۵ کیلوبایت می شود.

در نتیجه، شما باید انتخاب DNA پلیمراز مناسب برای PCR خود را بر اساس گزینه های زیر انتخاب کنید:

• برای PCR عمومی و روتین ، از یک پلیمراز DNA معمولی مانند Taq استفاده کنید.
• برای بیان ژن یا آزمایش جهش زایی، از آنزیم تصحیح کننده استفاده کنید.
• برای محصول تمیز و بازده بالا از پلیمراز hot-start استفاده کنید.
• برای آمپلیکون های طولانی از یک پلیمراز DNA دوربرد استفاده کنید.

 

در جدول زیر خصوصیات مهم در انتخاب DNA پلیمراز مناسب برای PCR که باید در  در نظر گرفته شود، لیست شده است.

 

PCR Polymerases	۳′–>5′ اگزونوکلئاز	Fidelity	۵′–>3′ اگزونوکلئاز	Nick Translation	انتهای قطعه	شرکت تولید کننده	کشور تولید کننده	توضیحات	کاربرد
Q5® High-Fidelity DNA Polymerase	++++	۲۸۰x Taq	No	No	Blunt				Ultra high-fidelity PCR, long range PCR, cloning from in vitro material for protein expression or gene analysis, SNP analysis via cloning and sequencing, site directed mutagenesis
									NGS library prep
Q5U® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase	++++		No	No	Blunt				USER cloning, high fidelity amplification of bisulfite converted or deaminated DNA substrates, carryover prevention
Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase*	++++	۳۹b-50xc Taq	No	No	Blunt				High-Fidelity PCR, cloning
OneTaq® DNA Polymerase	++	۲x	Yes	Yes	۳’A/Blunt				Routine PCR, colony PCR, genotype screening
Taq DNA Polymerase	_	۱x	Yes	Yes	۳’A				Routine PCR
									Multiplex end point PCR
LongAmp® Taq DNA Polymerase	++	۲x	Yes	Yes	۳’A/Blunt				Long range PCR for complex and simple templates
Hemo KlenTaq	_		No	No	۳’A				Blood direct PCR
Epimark® Hot Start Taq DNA Polymerase	_		Yes	Yes	۳’A				Bisulfite converted DNA amplification, AT rich templates
Isothermal Amplification and Strand Displacement	۳′–>5′ Exonuclease	Error Rate (x 10-6)	۵′–>3′ Exonuclease	Nick Translation	Resulting Ends				Applications
Bst DNA Polymerase, Full Length	_		Yes	Yes	۳’A				Nick translation
Bst DNA Polymerase, Large Fragment	_		No	No	۳’A				Isothermal Amplification (LAMP, SDA) molecular diagnostic, field diagnostics
Bst 2.0 DNA Polymerase	_	۶۲ (±۵)e	No	No	۳’A
Bst 3.0 DNA Polymerase	_	۷۰ (±۲۳)e	No	No	۳’A
Bsu DNA Polymerase, Large Fragment	_		No	No	۳’A				Isothermal Amplification (RPA, SDA, RCA)
phi29 DNA Polymerase	++++	۵i	No	No	Blunt				WGA
Polymerases for DNA Manipulation	۳′–>5′ Exonuclease	Error Rate (x 10-6)	۵′–>3′ Exonuclease	Nick Translation	Resulting Ends				Applications
T7 DNA Polymerase (unmodified)	++++	۱۵h	No	No	Blunt
Sulfolobus DNA Polymerase IV	_		No	No	۳’A				Trans lesion bypass
Therminator™ DNA Polymerase	_		No	No	۳’A				Chain terminator
DNA Polymerase I (E. coli)	++	۹f	Yes	Yes	Blunt				Second strand synthesis, nick translation
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment’	++	۱۸g	No	No	Blunt				Blunting, primer extension
Klenow Fragment (3′→۵′ exo_)	_	۱۰۰g	No	No	۳’A				A tailing, random priming labeling
T4 DNA Polymerase	++++	<1f	No	No	Blunt				Blunting
Legacy Polymerases	۳′–>5′ Exonuclease	Error Rate (x 10-6)	۵′–>3′ Exonuclease	Nick Translation	Resulting Ends				Applications
Vent® DNA Polymerase	++		No	No	Blunt
Vent® (exo–) DNA Polymerase	_		No	No	۳’A
Deep Vent® DNA Polymerase	+++		No	No	Blunt
Deep Vent® (exo–) DNA Polymerase	_		No	No	۳’A

 

لینک های مفید

• انتخاب پلیمراز مناسب
• مطالعه بیشتر
• اصول PCR