در این مقاله شما با روش انتخاب محیط کشت مناسب آزمایش خود به کمک معرفی انواع محیط کشت، خلاصه ایی از کاربردها و ویژگی ها، مواد مورد استفاده و … آشنا خواهید شد.

ابتدا چند تعریف پایه را در مورد محیط‌های کشت با هم مرور می‌کنیم.

محیط کشت چیست؟

محیط کشت، ظرفی حاوی مایع یا ژل می‌باشد که به‌منظور رشد دادن میکروب‌ها، سلول‌ها یا حتی گیاهان کوچک مورداستفاده قرار می‌گیرد.

محیط‌های کشت به طور معمول شامل دودسته می‌باشند، کشت سلولی (گیاهی – جانوری) و کشت میکروبی

معمولاً محیط کشت از چه موادی ساخته شده؟

به‌طورکلی محیط کشت‌ها از اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها، نمک‌های معدنی، گلوکز و سرم (به‌عنوان منبع رشد)، هورمون‌ها و … تشکیل شده‌اند. همچنین برای برخی از این محیط کشت‌ها تثبیت ph، دما و رطوبت امری لازم‌الاجرا است که به کمک تجهیزات مخصوص این امر میسر می‌شود.

انواع محیط کشت

به‌طورکلی برای هر 5 دسته سلول‌های جانوری، گیاهی، قارچی، باکتریایی و ویروسی 5 محیط کشت خاص وجود دارد.

محیط کشت جانوری

سلول‌های جانوری را می‌توان با استفاده از یک محیط کاملاً طبیعی یا یک محیط مصنوعی با افزودن برخی فراورده‌های آلی و طبیعی کشت کرد.

Users	Examples	Media Type	Media
	plasma, serum, lymph, human placental cord serum, amniotic fluid	Biological Fluids	Natural media
	Extract of liver, spleen, tumors, leucocytes and bone marrow, extract of the bovine embryo and chick embryo	Tissue Extracts	Natural media
	coagulants or plasma clots	Clots	Natural media
Form the basis of complex media	PBS, DPBS, HBSS, EBSS	Balanced salt solutions	Artificial media
Primary and diploid culture	MEM DMEM	Basal media	Artificial media
Supports a wide range of mammalian cells	RPMI-1640, IMDM	Complex media	Artificial media

محیط کشت‌های طبیعی

محیط کشت‌های طبیعی فقط از مایعات بیولوژیکی طبیعی تشکیل شده‌اند و همچنین برای کشت طیف وسیعی از سلول‌های جانوری بسیار مفید و مناسب هستند. اشکال عمده محیط کشت‌های طبیعی، ضعف در تکثیرپذیری آنهاست زیرا ترکیب دقیق این محیط‌های کشت معلوم نیست.

محیط کشت‌های مصنوعی

محیط کشت‌های مصنوعی با افزودن مواد مغذی (اعم از آلی و معدنی)، ویتامین‌ها، نمک‌ها، گازهای O2 ،CO2 و …، پروتئین‌های سرم، کربوهیدرات‌ها، کوفاکتورها آماده می‌شوند.

محیط کشت‌های مصنوعی متنوعی بر حسب نیاز به‌مرورزمان ابداع و کشف گردید که شامل:

1) محیط کشت ضروری، مناسب زنده ماندن فوری (محلول نمک متعادل، با pH خاص و فشار اسمزی)

2) محیط کشت مدت‌دار، مناسب بقای طولانی‌مدت (یک محلول نمک متعادل با فرمول‌های مختلف ترکیبات آلی و یا سرم)

3) محیط کشت با امکان رشد نامحدود

4) محیط کشت با امکان عملکردهای تخصصی

اقسام کشت سلولی

کشت اولیه

کشت اولیه نوعی سیستم کشت سلولی است که سلول‌ها مستقیماً از بافت به‌دست‌آمده‌اند و تا زمانی که تمام سطح کشت را بپوشانند به تکثیر خود ادامه می‌دهند.

برای کشت اولیه، اولین قدم جداسازی بافت از اندام و سپس جداکردن سلول‌ها از بافت‌ها می‌باشد. با افزودن تریپسین می‌توان این کار انجام داد.

سپس سلول‌ها را در محیط کشت مخصوص که به‌تازگی آماده کرده‌اید، رشد دهید و فلاسک کشت را برای ایجاد شرایط مناسب رشد سلول‌ها انکبه به نمایید.

پس از اولین کشت، کشت اولیه به‌عنوان لاین سلولی یا ساب کلون شناخته می‌شود.

کشت ثانویه

هنگامی که سلول‌های حاصل از کشت اولیه بر حسب کانفلوئنسی جدا شده و در محیط کشت جدید رشد داده می‌شوند، به آن کشت ثانویه می‌گویند.

کشت ثانویه به‌عنوان ساب کالچر یا پاساژ سلولی نیز شناخته می‌شود.

به دلیل وجود مواد مغذی تازه و همچنین فضای بیشتر برای رشد و تکثیر سلول‌ها در کشت ثانویه، می‌توان از این روش برای تکثیر متوالی سلول‌ها بدون نگرانی از سمی شدن محیط کشت (به دلیل متابولیت‌های ثانویه ایجاد شده) استفاده نمود.

سلول‌های حاصل از کشت اولیه توسط تریپسین/EDTA از یکدیگر جدا می‌شوند. تریپسین، یک سرین پروتئاز است که پروتئین خارج سلولی یا پروتئین ماتریکس را به‌طوری که سلول‌ها آزاد شوند هضم می‌کند. EDTA نیز یک عامل کلات کننده است. یون کلسیم به دلیل کمک به چسبندگی سلول باید کلاته شده و سلول‌ها در محیط رها شوند.

لاین سلولی محدود و نامحدود (پیوسته)

به طور معمول، سلول‌ها در زمان مشخصی فرایند تکثیر خود را به انجام می‌رسانند. پس از سپری شدن این مدت‌زمان، آنها توانایی تکثیرشان را از دست می‌دهند و شروع به پیر شدن می‌کنند. این رده از سلول‌ها، به خط سلولی محدود شناخته می‌شوند.

همچنین به خط سلولی که از نظر شیمیایی یا ویروسی دچار تغییر شده‌اند (transformation) و توانایی تکثیر نامحدود به دست آورده‌اند را رده سلولی پیوسته می‌گویند.

ویژگی‌های رده سلولی محدود

مهار تماسی (Contact inhibition)
وابستگی به کف برای رشد (anchorage dependence)
نرخ رشد پایین (low growth rate)

ویژگی‌های رده سلولی پیوسته (نامحدود)

بدون مهار تماسی
بدون وابستگی به کف ظرف جهت رشد
نرخ رشد و تکثیرپذیری بالا
رده سلولی محدود، به‌صورت محیط کشت تک‌لایه رشد می‌کند، یعنی سلول‌ها کف ظرف کشت را به طور یکنواخت می‌پوشانند.
رده سلولی پیوسته ممکن است به‌صورت تک‌لایه و یا کشت سوسپانسیون رشد کند. (سلول‌ها به کف نمی‌چسبند و در محیط کشت معلق می‌مانند)

رده‌های سلولی که به طور معمول در آزمایشگاه مورداستفاده قرار می‌گیرند

Application	Phenotype	Tissue	Cell name
Protein expression, virus production, transient transfection	Suspension	Insect ovary	Sf9 (Spodoptera frugiperda)
Protein expression, virus production, transient transfection	Normally grown adherently but sometimes adapted to suspension culture	Hamster kidney	BHK-21
Virus isolation, Antiviral drug testing, Plaque Reduction Neutralization Test (PRNT)	Adherent	African monkey kidney	Vero
Preferentially used for replication of Dengue virus to high titer	Adherent	Aedes aegypti larva	C6/36

پیش‌نیازهای کشت سلولی

بستر یا محیطی که مواد مغذی ضروری (اسیدهای آمینه، کربوهیدرات‌ها، ویتامین‌ها، مواد معدنی) را تأمین کند.
فاکتورهای رشد (FBS)
هورمون‌ها
گازها (O2 , CO2)
کنترل و تنظیم شرایط فیزیکی و شیمیایی محیط (دما، PH،فشار اسمزی)
تجهیز آزمایشگاه (سیفتی کابینت / هود لامینار / BOD)
پیپت استریل سرولوژیکی
محلول تریپسین/EDTA
بافر سالین فسفات
فلاسک کشت T-25/T-75
محلول پنی‌سیلین/استرپتومایسین (برای جلوگیری از آلودگی باکتریایی)
موارد 1 و 2 جهت افزایش رشد و تکثیر سلول‌ها اضافه می‌گردد و جز پیش‌نیازهای ضروری محیط کشت سلولی نمی‌باشد.

موارد استفاده از محیط کشت‌ طبیعی و مصنوعی

Example	Type	Definition	Category
Plasma separated from heparinized blood, serum, and fibrinogen	Coagulant or clots	Consisting of natural biological substances, such as plasma, serum, and embryo extract	Natural media
Extracts of chicken embryos, liver, and spleen and bone marrow extract	Tissue extracts	Consisting of natural biological substances, such as plasma, serum, and embryo extract	Natural media
Plasma, serum, lymph, amniotic fluid, and pleural fluid	Consisting of natural biological substances, such as plasma, serum, and embryo extract	Consisting of natural biological substances, such as plasma, serum, and embryo extract	Natural media
Human, bovine, equine, or other serum is used as a supplement	Serum-containing media	Composed of a basal medium and supplements, such as serum, growth factors, and hormones	Synthetic media
Crude protein fractions, such as bovine serum albumin or cor B-globulin, are used as supplements	Serum-free media	Composed of a basal medium and supplements, such as serum, growth factors, and hormones	Synthetic media
supplements Human source components, such as human serum albumin, are used as supplements but animal components are not allowed as supplements	Xeno-free media	Composed of a basal medium and supplements, such as serum, growth factors, and hormones	Synthetic media
Undefined components, such as peptide fractions (protein hydrolysates) are used as supplements	Protein-free media	Composed of a basal medium and supplements, such as serum, growth factors, and hormones	Synthetic media
Undefined components, such as crude protein fractions, hydrolysates, and tissue extracts, are not appropriate as supplements, but highly purified components, such as recombinant proteins are appropriate supplements	Chemically defined media	Composed of a basal medium and supplements, such as serum, growth factors, and hormones	Synthetic media

قبل از پاساژ سلولی به موارد زیر دقت کنید

1) برای استریل کردن هود کشت از اشعه ماوراء بنفش (UV) استفاده نمایید.

2) قبل از شروع، محیط را که در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری می‌کنید، در دمای اتاق قرار دهید.

3) هود را با الکل 70 درصد تمیز کنید.

4) سپس تمام وسایل و ظروف را پس از ضدعفونی زیر هود کشت نگهداری کنید.

5) ظرف مخصوص دورریز اضافات محیط کشت را زیر هود و در دسترس خود قرار دهید.

6) کانفلوئنسی سلول‌ها را زیر میکروسکوپ بررسی کنید که مطمئن شوید سلول‌ها سالم باشند

7) هرگز سلول‌هایی را که کانفلوئنت نشده‌اند را پاساژ ندهید زیرا به سلول استرس وارد می‌شود. سلول‌ها بسیار شکننده و حساس هستند، بنابراین بادقت و ملایم با آنها کار کنید.

8) همیشه دست‌های خود را با اتیل الکل 70 درصد تمیز کنید.

9) قبل از استفاده از تریپسین/EDTA، دمای آن را به 37 درجه برسانید

روش جداسازی و پاساژ دهی از لاین سلولی اولیه

(مانند رده سلولی Vero که یک رده سلولی چسبنده است)

فلاسک کشت کانفلوئنت شده را برداشته و تمام محیط کشت مصرف شده را با کمک پپتید سرولوژیک جدا کنید.
تک‌لایه سلولی ایجاد شده را با کمک بافر فسفات سالین شستشو دهید.
1 میلی‌لیتر محلول تریپسین/EDTA را به‌طوری بر روی سلول‌ها ریخته که تمام سطح آنها را پوشش دهد.
مقداری از محلول تریپسین را کم کنید
فلاسک را در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور BOD به مدت 90 ثانیه قرار دهید.
به‌آرامی کنار فلاسک ضربه بزنید تا سلول‌ها از جای خود خارج شوند (کنده شوند).
حدود 2-3 میلی‌لیتر از محیط DMEM 10% کامل را به فلاسک اضافه کنید تا سلول‌هایی که از جای خود خارج شده‌اند را بشوید.
تیوب‌های حاوی سلول‌ها را به مدت 5 دقیقه و با سرعت 1500 دور بر دقیقه سانتریفیوژ دهید.
پلت سلولی شکل می‌گیرد.
اکنون پلت را در 2 میلی‌لیتر DMEM حل نمایید (DMEM مورداستفاده تازه باشد)
سلول‌ها را به کمک لام هموسیتومتر شمارش کنید و سپس آنها را برای ایجاد لاین سلولی جدید، بادقت، به فلاسک دیگری انتقال دهید.
فلاسک را 24 ساعت بعد به‌منظور برسی کیفیت و عدم آلودگی، چک نمایید.
سلول‌های فلاسک را یک روز در میان جدا کنید و در فلاسک دیگری پاساژ دهید تا رده سلولی برای مدت طولانی (تا 30 پاساژ) حفظ شود.

آلودگی در محیط کشت سلولی

آلودگی رده سلولی به معنای چیزی است که در سیستم کشت نامطلوب است و باعث می‌شود که محیط کشت ما در فلاسک کشت سلولی تار و مبهم باشد. درحالی‌که باید واضح باشد.
دو دلیل کلی برای آلودگی محیط کشت در نظر گرفته می‌شود:

آلودگی شیمیایی

این نوع آلودگی ممکن است از هر نوع محلولی که طی انجام آزمایش به محیط کشت اضافه می‌نماییم، رخ دهد. برای مثال:

آلودگی محیط DMEM
آلودگی بافر فسفات
آلودگی محلول‌های تریپسین/EDTA
همچنین ممکن است آلودگی حین انکوباسیون رخ دهد.

آلودگی بیولوژیکی

همان‌طور که از نام آن پیداست، این نوع آلودگی، منشأ زیستی داشته و در فرایند کشت سلولی اختلال ایجاد می‌کنند. از جمله این آلودگی‌ها می‌توان به:

آلودگی باکتریایی
آلودگی قارچی
آلودگی با مایکوپلاسما (عموماً با چشم غیرمسلح نیز قابل‌مشاهده است)
آلودگی کراس با دیگر لاین‌های سلولی (هنگامی که دو لاین سلولی متفاوت پشت‌سرهم و بدون انتشار UV متفاوت تقسیم انجام می‌دهند، این نوع آلودگی ایجاد شده و صحت کل آزمایش را به خطر میندازند)

DMEM ,MEM ,RPMI کدام یک نیاز ما را برطرف میکند؟

در سطح بسیار ابتدایی در آزمایشگاه‌ها از DMEM برای رده سلولی چسبنده و از RPMI برای رده سلولی غیرچسبنده استفاده می‌شود اما بنا بر اقتضا از محیط کشت‌های حاوی آلفا -MEM یا گلوکز بالا/پایین بسته به تجربه قبلی کار با رده سلولی، نیز استفاده می‌شود. به‌عنوان‌مثال برخی از ردهای سلولی در حضور HEPEها رشد می‌کنند. همچنین قبل از کشت سلول باید در مورد استفاده‌ای ثانویه رده‌های سلولی فکر کرده باشید. به‌عنوان‌مثال اگر از رده سلولی خود برای سنجش فلورسانس استفاده می‌کنید، فنل قرمز باید از محیط کشت شما حذف شود زیرا فلورسانس بالایی دارد و در میزان خواندنش پس‌زمینه کشت شما تأثیر می‌گذارد. باید هنگام تصمیم‌گیری در مورد بهترین محیط کشت، همه جوانب در نظر بگیرید.

پیشنهاد می‌شود اگر به منابع تحقیقاتی مرتبط و به‌روز دسترسی دارید (برای مثال pubmed)، در مورد رده سلولی مورد آزمایش تحقیق کرده و سپس چند گزینه را که بیشترین استفاده را در مقالات داشته‌اند امتحان کنید تا به‌صورت تجربی متوجه شوید دقیقاً چه چیزی برای کشت شما بهترین نتیجه را دارد.