توضیحات

مارکر وزن مولکولی DNA یا DNA Ladder که از آن به‌عنوان پروتئین Ladder یا DNA و RNA ladder نیز یاد می‌شود، مجموعه‌ای از استانداردها است که برای شناسایی اندازه تقریبی یک مولکول در طول الکتروفورز روی یک ژل استفاده می‌شود. هنگامی که در ژل الکتروفورز  استفاده می‌شود، مارکرها به طور مؤثر مقیاس لگاریتمی را طی می‌کنند که با استفاده از آن می‌توان اندازه سایر قطعات را تخمین زد (با تهیه اندازه قطعات مارکر شناخته شده). مارکرهای پروتئین، DNA و RNA با اندازه و غلظت از پیش تعیین شده از نظر تجاری در دسترس هستند و می‌توانند در ژل آگارز یا پلی‌آکریل آمید اجرا شوند. قبل از شروع کار،  مارکرها در چاهک مجاور نمونه بارگیری می‌شوند.

اگرچه مفهوم مارکرهای وزن مولکولی حفظ شده است اما تکنیک‌های توسعه در طول سال‌ها متفاوت بوده‌اند. مارکرهای وزن مولکولی جدید در کیت‌های مخصوص نوع مارکر توزیع می‌شوند. یک مشکل اولیه در توسعه مارکرها دستیابی به‌وضوح بالا در تمام طول آن بود. بسته به شرایط عملکرد الکتروفورز ژل، قطعات ممکن است فشرده شده باشند و وضوح را مختل کنند. برای پرداختن به این مسئله، یک کیت برای آنالیز Southern Blot در سال ۱۹۹۰ تهیه شد و اولین نشانگر ترکیب DNA هدف و DNA پروب را تهیه کرد. این تکنیک از فاصله لگاریتمی استفاده کرده و برای شناسایی باندهای هدف با طول ۲۰،۰۰۰ نوکلئوتید استفاده کرد.

تولید مارکرهای وزن مولکولی DNA

دو روش متداول وجود دارد که در آنها می‌توان یک مارکر اندازه‌گیری وزن مولکولی DNA را ساخت. یکی از این روش‌ها از تکنیک لیگاسیون جزئی یا partial ligation استفاده می‌کند. لیگاسیون DNA فرایندی است که توسط آن قطعات DNA خطی از طریق پیوندهای کووالانسی به یکدیگر متصل می‌شوند. در اینجا، یک قطعه DNA دوبلکس با ۱۰۰bp جزئی متصل می‌شود. نتیجه این امر این است که دیمرهای ۲۰۰bp ، trimers 300bp ، tetramers 400bp ، pentamers 500bp و غیره تشکیل خواهند شد. علاوه بر این، بخشی از dsDNA 100bp باقی می‌ماند. در نتیجه، یک “نردبان” DNA متشکل از قطعات DNA از جرم مولکولی شناخته شده بر روی ژل ایجاد می‌شود.

روش دوم استفاده از آنزیم‌های محدودکننده و توالی DNA شناخته شده را به کار می‌برد. DNA توسط یک آنزیم محدودکننده خاص هضم می‌شود و در نتیجه تکه‌های DNA از جرم‌های مختلف مولکولی متغیر می‌شوند. یکی از مزایای این روش این است که به‌راحتی با هضم بیشتر DNA شناخته شده می‌توان مارکر بیشتری ایجاد کرد. از طرف دیگر، اندازه قطعات DNA بر اساس مکان‌هایی است که آنزیم محدودکننده کاهش می‌یابد. این امر کنترل اندازه قطعات موجود در نشانگر را دشوارتر می‌کند.

اخیراً، روش دیگری برای ساخت نشانگرهای با وزن مولکولی DNA توسط آزمایشگاه‌ها به کار گرفته شده است. این استراتژی شامل استفاده از واکنش PCR  است که با یک یا دو روش حاصل می‌شود:

۱) یک هدف DNA در همان زمان از طریق مجموعه‌های آغازگر تقویت می‌شود،

۲) اهداف مختلف DNA به طور مستقل از طریق آغازگرهای خاص تقویت می‌شوند.

تأثیر شرایط ژل همانند نمونه‌های آزمایشی، شرایط ژل می‌تواند روی نشانگر وزن مولکولی که در کنار آنها قرار دارد تأثیر بگذارد. عواملی مانند بافر، شارژ / ولتاژ و غلظت ژل می‌تواند بر تحرک و / یا ظاهر نشانگر / نردبان / استاندارد شما تأثیر بگذارد. هنگام انتخاب مارکر و هنگام تجزیه‌وتحلیل نتایج نهایی روی ژل، باید این عناصر موردتوجه قرار گیرد.

لینک های مفید

• • الکتروفورز مجازی
  • بهینه سازی PCR
  • تکنولوژی مارکر DNA
  • کاربردهای مختلف مارکرهای اندازه مولکولی
  • رنگ های رایج در تجسم و رنگ آمیزی DNA