توضیحات

دامنه کاربرد کیت سنجش پروتئین به روش برادفورد (پروتوسیب):

کیت پروتوسیب یک روش رنگ‌سنجی دقیق برای سنجش کمی پروتئین در محلول به روش برادفورد است. این کیت برای تعیین غلظت پروتئین در محلول کاربرد دارد.

اساس سنجش پروتئین به روش برادفورد:

زمانی که رنگ کوماسی در محیط اسیدی به پروتئین متصل شود؛ تغییر رنگ از قهوه‌ای (قهوه‌ای متمایل به سبز) به آبی رخ می‌دهد و طول موج بیشینه جذب از ۴۶۵ نانومتر به ۵۹۵ نانومتر (در حالت متصل به پروتئین) تغییر می‌کند. شدت جذب نور در ۵۹۵ نانومتر با غلظت پروتئین محلول رابطه مستقیم دارد. غلظت پروتئین در نمونه مجهول با استفاده از رسم منحنی استاندارد و معادله منحنی استاندارد و تعیین معادله منحنی، قابل محاسبه است.

تهیه رقت‌های استاندارد از آلبومین سرم گاوی(BSA):

۱ از جدول ۱ برای آماده‌کردن رقت‌ها، به‌عنوان راهنما استفاده نمایید.
۲ مطابق جدول از محلول استاندارد BSA در ۱۰ ویال تمیز بریزید و آنها را با بافر مناسب (ترجیحاً با استفاده از بافر نمونه پروتئینی مجهول) به حجم ۱ میلی‌لیتر برسانید.

سنجش پروتئین در میکروپلیت (محدوده ml/μg ۱۰۰ تا ۳۰۰)

۱ برای تهیه محلول‌های استاندارد از جدول ۲ استفاده کنید.
۲ نمونه پروتئین را در حجم مناسبی از بافر موردنظر رقیق کنید.
۳ μl 50 نمونه رقیق شده پروتئین مجهول و μl 50 از نمونه‌های را در
سه تکرار (در چاهک‌های میکروپلیت اضافه نمایید.
۴ μl 50 نمونه معرف کوماسی) که با محیط هم‌دما شده است را به هر
چاهک اضافه نمایید.
۵ میکروپلیت را بلافاصله با فویل آلومینیومی پوشانده و به مدت ۱۰ دقیقه
در دمای محیط نگهداری کنید.
۶ فویل آلومینیومی را برداشته و جذب نوری چاهک‌ها آزمون را در طول
موج nm 595 قرائت کنید.

سنجش پروتئین در میکروپلیت (محدوده ml/μg ۱۰ تا ۳۰):

۱ برای تهیه محلول‌های استاندارد از جدول ۱ استفاده کنید.
۲ نمونه پروتئین را در حجم مناسبی از بافر موردنظر رقیق کنید.
۳ μl 125 نمونه رقیق شده پروتئین مجهول و μl 125 از نمونه‌های استاندارد جدول ۱ را در سه تکرار (در چاهک‌های میکروپلیت اضافه نمایید.
۴ μl 125 نمونه معرف کوماسی) که با محیط هم‌دما شده است را به هر چاهک اضافه نمایید.
۵ میکروپلیت را بلافاصله با فویل آلومینیومی پوشانده و به مدت ۱۰ دقیقه دمای محیط نگهداری کنید.
۶ فویل آلومینیومی را برداشته و جذب نوری چاهک‌ها آزمون را در طول موج nm 595 قرائت کنید.

سنجش پروتئین در میکروتیوب (محدوده ml/μg ۱۰۰ تا ۳۰۰):

۱ نمونه پروتئین را در حجم مناسبی از بافر موردنظر رقیق کنید.
۲ μl 100 نمونه رقیق شده پروتئین مجهول و μl 100 از نمونه‌های استاندارد جدول ۲ را (در سه تکرار) در میکروتیوب‌های خالی و تمیز اضافه نمایید.
۳ μl 1000 نمونه معرف کوماسی (که با محیط هم‌دما شده است) را به هر میکروتیوب اضافه و ورتکس نمایید.
۴ میکروپلیت را به مدت ۱۰ دقیقه در دمای محیط و به‌دوراز نور مستقیم نگه‌داری کنید.
۵ جذب نوری محلول داخل میکروتیوب‌ها را در طول موج nm 595 قرائت کنید.

سنجش پروتئین در میکروتیوب (محدوده ml/μg ۱۰ تا ۳۰ ):

۱ نمونه پروتئین را در حجم مناسبی از بافر موردنظر رقیق کنید.
۲ μl 500 نمونه رقیق شده پروتئین مجهول و μl 500 از نمونه‌های استاندارد جدول ۱ را در سه تکرار در میکروتیوب‌های خالی و تمیز اضافه نمایید.

۳ μl 500 نمونه معرف کوماسی (که با محیط هم دما شده است) را به هر میکروتیوب اضافه و ورتکس نمایید.
۴ میکروتیوب‌ها را به مدت ۱۰ دقیقه در دمای محیط به‌دوراز نور مستقیم نگه‌داری کنید.
۵ با دستگاه اسپکتروفوتومتر، جذب نوری محلول داخل میکروتیوب‌ها را در طول موج nm 595 قرائت کنید. محاسبه غلظت پروتئین ۱ میانگین جذب نمونه رقیق شده پروتئین مجهول و استانداردهای مربوط به ستون‌های ۲ تا ۶ جدول را از میانگین جذب استاندارد ml/μg 0( ستون ۱ جدول) کسر کنید.
۲ منحنی استاندارد آلبومین سرم گاوی را با استفاده از میانگین اعداد دست آمده رسم و معادله منحنی استاندارد را به دست آورید. برای رسم منحنی استاندارد، مقادیر جذب را به‌عنوان محور y و غلظت استانداردها (بر حسب
ml/μg )به‌عنوان محور x در نظر بگیرید.
۳ میانگین جذب نمونه رقیق شده پروتئین مجهول را به‌عنوان y در معادله منحنی استاندارد قرار داده و غلظت واقعی پروتئین مجهول را با ضرب عدد به‌دست‌آمده (x )در میزان رقیق‌سازی پروتئین مجهول به دست آورید.

احتیاط و ایمنی در کار با کیت سنجش پروتئین به روش برادفورد (پروتوسیب):

قبل از هر بار سنجش، معرف کوماسی کیت را به مالیمت هم بزنید از تکان‌دادن شدید اجتناب شود برای هر بار انجام آزمون، مقدار معرف موردنیاز را
در یک ظرف شیشه‌ای کاملا تمیز با حجم مناسب ریخته و قبل از انجام آزمون صبر کنید تا با محیط هم دما شود. توجه داشته باشید غلظت نمونه رقیق شده باید در محدوده غلظت‌های منحنی استاندارد آلبومین سرم گاوی باشد. در غیر این صورت باید از نمونه مجهول
رقیق یا غلیظ‌تر در آزمون استفاده کرد.
قبل از هر بار سنجش، معرف کوماسی را از یخچال خارج کرده و به آرامی هم بزنید (از تکان دادن شدید بپرهیزید). برای هر بار انجام آزمون، مقدار معرف مورد نیاز را در یک ظرف شیشهای کامالتمیز با حجم مناسب ریخته و قبل از انجام آزمون صبر کنید تا با محیط هم دماشود.
بیشینه حساسیت آزمون زمانی بدست می‌آید که جذب کمپلکس معرفکوماسی- پروتئین در ۵۹۵ نانومتر اندازهگیری شود. در صورتیکه دستگاه اسپکتروفوتومتر یا پلیت ریدر فاقد فیلتر ۵۹۵ نانومتر باشد، جذب نمونه را درهر طول موجی بین ۵۷۰ تا ۶۱۰ قرائت کنید.
وسایل شیشهای، میکروپلیت و کووت‌ها باید کامال تمیز و بدون هر گونه لکه ورنگ باشد.

نگهداری از کیت سنجش پروتئین به روش برادفورد (پروتوسیب):

• کیت را در دمای ۴ تا ۸ درجه سانتیگراد و در محل تاریک نگهداری کنید.
• معرف کوماسی باعث ایجاد رنگ در کووت‌ها می‌شود. برای رفع این مشکل ازکووت های یکبارمصرف استفاده نمایید.

• رفرنس مطلب
• مشاهده سایر محصولات مرتبط

مطالب مرتبط

None found