توضیحات

آنزیم Taq DNA Polymerase یک پلیمراز DNA با مقاومت درجه حرارت بالا است که نام آن را با استفاده از میکروارگانیسم Eubacterial thermophilic Thermus aquaticus نامگذاری شده، که از آن ابتدا توسط Chien و همکاران  در سال ۱۹۷۶ جدا شده است. نام آن اغلب به اختصار Taq یا Taq pol بیان می شود. در واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) ، روشی برای تقویت مقدار کمی از بخش های کوتاه DNA استفاده می شود. T. aquaticus باکتریی است که در چشمه های آب گرم و دریچه های گرمابی زندگی می کند، و Taq polymerase به عنوان آنزیمی شناخته شده است که قادر به تحمل شرایط تخریب پروتئین (درجه حرارت بالا) در طول PCR است. بنابراین ، آن را جایگزین DNA پلیمراز E. coli که در ابتدا در PCR استفاده میشد کرده اند.

در اوایل دهه ۱۹۸۰ ، کری مولیس در شرکت Cetus مشغول به کارگیری DNA های مصنوعی در بیوتکنولوژی بود. او با استفاده از الیگونوکلئوتیدهای DNA به عنوان پروب اتصال به رشته های DNA هدف و همچنین استفاده از آنها به عنوان آغازگرهای توالی DNA و سنتز cDNA آشنا بود. در سال ۱۹۸۳ ، او شروع به استفاده از دو آغازگر ، یکی برای هیبریداسیون به هر رشته از DNA هدف ، و اضافه کردن DNA پلیمراز به واکنش کرد. این امر به تکثیر DNA نمایی منجر شد، تا حد زیادی بخشهای گسسته DNA را بین آغازگرها تقویت می کند. با این حال ، پس از هر دور از تکثیر، مخلوط باید بیش از ۹۰ درجه سانتیگراد گرم شود تا DNA جدید تشکیل شود ، بنابراین رشته ها می توانند در دور بعدی تقویت از یکدیگر جدا شده و به عنوان الگو عمل کنند. این مرحله گرمایش همچنین DNA پلیمراز را که قبل از کشف پلیمراز Taq ، قطعه Klenow (که از E. coli تهیه شده است) غیرفعال می کند. پلیمراز Taq برای این کاربرد مناسب است زیرا قادر به مقاومت در برابر دمای ۹۵ درجه سانتیگراد است که برای جداسازی رشته DNA بدون دناتور کردن لازم است.استفاده از Taq از لحاظ دما ، امکان اجرای PCR را در دمای بالا (۶۰ درجه سانتیگراد و بالاتر) فراهم می آورد ، که باعث افزایش خاصیت اولیه آغازگرها و کاهش تولید محصولات غیر اختصاصی مانند دیمر آغازگر می شود. همچنین ، استفاده از یک پلیمراز مقاوم دما ، نیاز به افزودن آنزیم جدید به هر دور از حرارتی را از بین می برد. یک لوله بسته منفرد در یک دستگاه نسبتاً ساده می تواند برای انجام کل مراحل مورد استفاده قرار گیرد. بنابراین ، استفاده از پلیمراز Taq ایده اصلی بود که باعث شد PCR برای بسیاری از مشکلات زیست شناسی مولکولی در رابطه با تجزیه و تحلیل DNA کاربردی باشد

هافمن-لا روشه سرانجام حق ثبت اختراعات PCR و Taq را از Cetus به قیمت ۳۳۰ میلیون دلار خریداری کرد که از این مبلغ ممکن است تا ۲ میلیارد دلار حق امتیاز حق الوکاله دریافت شود. در سال ۱۹۸۹ ، مجله Science  این آنزیم را به عنوان اولین “مولکول سال” نامگذاری کرد. کری مالیس در سال ۱۹۹۳ جایزه نوبل شیمی را دریافت کرد، تنها کسی که برای تحقیقات انجام شده در یک شرکت فناوری بیوتکنولوژی آن را دریافت کرده. در اوایل دهه ۱۹۹۰ ، تکنیک PCR با پلیمراز Taq در بسیاری از رشته ها از جمله تحقیقات اساسی زیست شناسی مولکولی، آزمایش بالینی و پزشکی قانونی مورد استفاده قرار گرفت. همچنین در یافتن مستقیم ویروس HIV در ایدز، یک کاربرد مهم پیدا کرد.

در دسامبر سال ۱۹۹۹ ، قاضی ناحیه ایالات متحده ، ووون واکر حکم داد که حق ثبت اختراع ۱۹۹۰ مربوط به تاک پلیمراز تا حدودی به اطلاعات غلط و ادعاهای دروغین توسط دانشمندان با شرکت ستوس صادر شده است. این حکم از شرکت Promega در برابر هوفمن-لا روشه ، که در سال ۱۹۹۱ اختراعات ثبت شده Taq را خریداری کرد ، حمایت کرد. قاضی واکر اکتشافات قبلی سایر آزمایشگاه ها ، از جمله آزمایشگاه استاد جان ترلا را در گروه علوم بیولوژیک دانشگاه سینسیناتی عنوان کرد.

دمای مطلوب Taq برای فعالیت ۷۵-۸۰ درجه سانتیگراد است ، با نیمه عمر بیشتر از ۲ ساعت در ۹۲٫۵ درجه سانتیگراد، ۴۰ دقیقه در ۹۵ درجه سانتیگراد و ۹ دقیقه با دمای ۹۷٫۵ درجه سانتیگراد ، و می تواند یک رشته جفت باز ۱۰۰۰ DNA را در کمتر از ۱۰ ثانیه با دمای ۷۲ درجه سانتیگراد همانند سازی کند. در دمای ۷۵-۸۰ درجه سانتیگراد ، Taq به سرعت پلیمریزاسیون مطلوب خود در حدود ۱۵۰ نوکلئوتید در ثانیه در هر مولکول آنزیم می رسد و هرگونه انحراف از محدوده دمای مطلوب ، مانع از افزایش سرعت آنزیم می شود. یک Taq حدود ۶۰ نوکلئوتید در ثانیه در دمای ۷۰ درجه سانتیگراد ، ۲۴ نوکلئوتید در ثانیه در ۵۵ درجه سانتیگراد ، ۱٫۵ نوکلئوتید در ثانیه در ۳۷ درجه سانتیگراد و ۰٫۲۵ نوکلئوتید در ثانیه در ۲۲ درجه سانتی گراد سنتز می کند. در دماهای بالاتر از ۹۰ درجه سانتیگراد ، Taq فعالیت بسیار کمی یا ناچیزی را نشان می دهد، اما خود آنزیم تخریب نمی شود و دست نخورده باقی می ماند. وجود یونهای خاصی در واکنش نیز بر فعالیت خاص آنزیم تأثیر می گذارد. مقادیر کمی کلرید پتاسیم (KCl) و یون منیزیم (Mg2 +) فعالیت آنزیمی Taq را تقویت می کنند. پلیمراز Taq در حداکثر ۵۰mM KCl و فقط غلظت مناسب Mg2 + که با غلظت تری فسفاتهای نوکلئوزید (dNTPs) تعیین می شود ، فعال می شود. غلظت بالای KCl و Mg2 فعالیت Taq را مهار می کند.

جالب است بدانید ،  EDTA ، در صورت عدم وجود این یون های فلزی ، مستقیماً به Taq متصل می شود.

یکی از اشکالاتی که در taq  وجود دارد ، عدم فعالیت ۳ تا ۵ اگزونوکلئاز و در نتیجه صحت نسبتاً کم است. در ابتدا میزان خطای آن در حدود ۱ در ۹۰۰۰ نوکلئوتید اندازه گیری شد. برخی از پلیمرازهای DNA با درجه حرارت بالا از سایر باکتریهای ترموفیلیک و آرکیها جدا شده اند ، مانند Pfu DNA پلیمراز، دارای فعالیت تصحیح هستند و به جای (یا در ترکیب با) Taq برای تقویت استفاده می شود. صحت می تواند تفاوت زیادی با Taq داشته باشد و دارای تأثیرات عمیقی در برنامه های توالی یابی پایین دست باشد.

Taq محصولات دی ان ای را تولید می کند که دارای A (آدنین) در انتهای ۳ ‘خود هستند که می تواند در کلونینگ TA مفید باشد، به موجب آن یک وکتور کلونینگ (مانند یک پلاسمید) که دارای یک T (تیمین) ۳ ‘overhang است ، که با A overhang محصول PCR تکمیل می شود ، در نتیجه امکان اتصال محصول PCR به وجود می آید.

لینک های مفید

•  DNA پلیمراز مناسب برای PCR
• اصول کار PCR
• Taq-DNA polymerase