توضیحات

مارکرهای پروتئینی یا Protein Ladder

پیش‌ازاین، مارکرهای پروتئینی با استفاده از انواع پروتئین‌های کامل تولید شده بودند. توسعه کیت شامل یک مارکر اندازه‌گیری وزن با استفاده از قطعات پروتئینی در سال ۱۹۹۳ آغاز شد. این مارکر پروتئین که از ۴۹ توالی اسیدآمینه مختلف تشکیل شده است، شامل پروتئین‌های مولتی دامین بوده و امکان تجزیه‌وتحلیل پروتئین‌های شکسته شده در مکان‌های مختلف را فراهم می‌کند. اولین مارکر پروتئین  با وزن مرتب شده به طور خودکار، در سال ۲۰۱۲ اختراع شد.

تولید

مشابه نشانگرهای DNA ، این مارکرها معمولاً از پروتئین‌های خالص تشکیل شده‌اند که توده‌های مولکولی آنها از قبل شناخته شده است. لیست زیر برخی از پروتئین‌ها و همچنین اجرام مولکولی را توصیف می‌کند که معمولاً هنگام ساختن نشانگر پروتئین مورداستفاده قرار می‌گیرد.

انتخاب مارکر پروتئین مناسب

مارکرهای وزن مولکولی را می‌توان به دودسته تقسیم کرد:

مارکرهای وزن مولکولی در مقابل نشانگرهای نردبان مولکولی.

مارکرها رنگ‌آمیزی شده یا بی‌رنگ هستند و بسته به شرایط ممکن است یکی از دیگری مناسب‌تر باشد. مارکرهای با وزن مولکولی نیز می‌توانند تغییر بیوشیمیایی کنند. ترکیب با بیوتین رایج است. مارکرهای با وزن مولکولی بیشتر در الکتروفورز ژل SDS-polyacrylamide و وسترن‌بلات استفاده می‌شود. با وجود انواع مختلف و کاربردهای مختلف مارکرهای با وزن مولکولی، انتخاب استاندارد پروتئین مناسب بسیار مهم است. علاوه بر استفاده رایج به‌عنوان روشی برای محاسبه وزن مولکولی نمونه‌ها، سایر کاربردها شامل اجازه به‌دست‌آوردن شواهد بصری از انتقال پروتئین و بازده انتقال می‌شود و بعضی اوقات حتی برای کنترل مثبت نیز استفاده می‌شود.

مارکرهای  وزن مولکولی MW در مقابل پروتئین Ladder

مارکر وزن مولکولی یک نوع استاندارد پروتئین است. آنها می‌توانند قبل از لود از پیش رنگ‌آمیزی شده یا غیر رنگ شده باشند. بسته به نوع آزمایش ممکن است یکی از آن‌ها بهتر باشد. در هر دو حالت، معمولاً روی خط بیرونی ژل لود می‌شوند، درحالی‌که نمونه در چاهک میانی بارگذاری می‌شود. مارکرهای مولکولی با نردبان پروتئین متفاوت است زیرا از ترکیبی از پروتئین‌های native تشکیل شده است که مشخصات آنها به‌خوبی طبقه‌بندی شده‌اند اما با همه اعداد مطابقت ندارند. به‌طورکلی اینها بسیار ارزان‌تر هستند، اما تجزیه‌وتحلیل فقط به یک مقدار تقریبی پروتئین‌های جدا شده الکتروفورز اجازه می‌دهد.

پروتئین Ladder نوع دیگری از استاندارد پروتئین است. آنها تقریباً همیشه رنگ‌آمیزی می‌شوند. نردبان پروتئین با مارکرهای مولکولی تفاوت دارد زیرا از ترکیبی از پروتئین‌های بسیار خالص که مشخصات آنها مشخص است و با تعداد کامل مطابقت دارد تشکیل شده است. معمولاً نردبان پروتئینی از ۱۰-۱۲ پروتئین تشکیل شده است. در پایان آزمایش، پس از مهاجرت باندها، یک باند واحد اندازه هر پروتئین موجود در نردبان را نشان می‌دهد. نشانگرها به فاصله مساوی از هم قرار دارند و تجزیه‌وتحلیل اندازه با استفاده از این نشانگرها، می‌تواند یک مقدار دقیق پروتئین موردنظر را فراهم کند. در بعضی موارد، به‌عنوان یک روش تأیید مولکولی، نشانگرهای MW و نردبان پروتئینی جهت تأیید استفاده می‌شوند.

مارکرهای از پیش رنگ شده و رنگ نشده

مارکرهای پروتئینی می‌توانند از پیش رنگ شده یا رنگ نشده باشند، اما هر دو مزایا و معایبی دارند. تجسم ساده جداسازی و انتقال پروتئین با استفاده از نشانگرهای از پیش رنگ شده امکان‌پذیر است. آنها معمولاً در هر دو الکتروفورز ژل SDS-polyacrylamide و وسترن‌بلات استفاده می‌شوند. در SDS-PAGE امکان کنترل مهاجرت پروتئین را فراهم می‌کند، زیرا نوارهای پروتئینی از هم جدا می‌شوند و در طول یک دوره الکتروفورز مشاهده می‌شود. در لکه‌های غربی، استانداردهای پروتئین رنگ‌آمیزی شده امکان تجسم انتقال پروتئین بر روی غشاء را فراهم می‌کنند. بااین‌حال، تعیین اندازه با این نشانگرها چندان دقیق نیست. درحالی‌که نشانگرهای رنگ نشده تعیین‌کننده اندازه دقیق‌تری هستند، اما درحالی‌که ژل در حال کار است، نمی‌توان آنها را مشاهده کرد. به‌این‌ترتیب، برای تجسم باندها باید ژل رنگ‌آمیزی شود.

مارکرهای نوترکیب و طبیعی

علاوه بر نشانگرهای رنگ‌آمیزی و بدون رنگ‌آمیزی، می‌توان مارکرهای پروتئینی را از نظر نوترکیب و طبیعی تصور کرد. نشانگرهای نوترکیب از پروتئین‌های نوترکیب تشکیل شده‌اند که تا حد زیادی خالص شده‌اند. این نشانگرها به‌گونه‌ای طراحی شده‌اند که ویژگی‌های خاص را برجسته می‌کنند. نمونه‌هایی از این خصوصیات شامل برچسب‌های تمایلی و وزن مولکولی است که به طور یکنواخت نسبت به یکدیگر قرار گرفته‌اند. نشانگرهای طبیعی، همان‌طور که از نام آنها پیداست، ترکیبی از پروتئین است که به طور طبیعی اتفاق می‌افتد. نشانگرهای طبیعی رنگ‌آمیزی شده برای تجسم جداسازی ژل به‌خوبی کار می‌کنند. بااین‌حال، این نشانگرها تمایل دارند به‌صورت کووالانسی در مقادیر مختلف و در موقعیت‌های مختلف به رنگ متصل شوند. در نتیجه، باندهای حاصل ممکن است گسترده‌تر باشد. این امر به‌ویژه در مقایسه با نشانگرهای نوترکیب از پیش رنگ شده صادق است. باتوجه‌به این اثر، تعیین وزن مولکولی به‌احتمال زیاد با نشانگرهای طبیعی پیش‌بینی‌شده دقت کمتری دارد.

مارکرهای تغییریافته

استانداردهای پروتئین را همچنین می‌توان از نظر شیمیایی تغییر داد. یک تغییر شایع استفاده از بیوتین است. بیوتین، به استرپتاویدین بسیار وابسته است و بنابراین، اتصال باعث ایجاد یک مجموعه بسیار قوی می‌شود. برای تجسم، برچسب رنگی به استرپتاویدین وصل شده است.

تأثیر شرایط ژل

مانند الکتروفورز DNA، شرایطی مانند بافر، بار / ولتاژ و غلظت باید هنگام انتخاب یک نشانگر پروتئین در نظر گرفته شود.

لینک های مفید

• مارکرهای پروتئینی برای ژل ها و بلاتینگ
• پروتوکل انجام Laemelli SDS-PAGE
• پروتوکل انجام وسترن بلات