محیط کشت استئوپلاس

محیط کشت OsteoPlus ایده زیست نوترکیب

محیط کشت استئوپلاس (OsteoPlus) یک محیط کشت تمایزی است که برای تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی به سلول های استخوان (استئوسیت) بهینه شده است. فرمولاسیون این محیط کشت بر پایه اجزای ضروری فرایند استئوژنز شامل دگزامتازون، بتا-گلیسرول فسفات، سدیم پیروات، و آسکوربیک اسید در محیط DMEM-Low Glucose حاوی سرم جنین گاوی بهینه شده است. توصیه می شود این محیط کشت تنها برای تمایز سلول های انسانی استفاده شود؛ درغیر اینصورت ممکن است نتایج نامناسبی بدست آید.

شرایط نگهداری و استفاده از محیط کشت استئوپلاس ایده زیست نوترکیب

• استئوپلاس در 2 تا 8 درجه سانتیگراد تا 1 ماه پایدار است. برای نگهداری درازمدت، باید محیط را در مقادیر کوچک الیکوت و فریز کنید. با این حال، انجماد میزان تمایز را کاهش می دهد.
• محیط را فریز و ذوب مکرر نکنید.
• این محیط با گلوتامکس غنی شده است.
• محیط باید شفاف و قرمز رنگ باشد. در صورت تغییر رنگ، از محیط استفاده نکنید.

مراحل پاساژ دادن و آماده سازی سلول های بنیادی مزانشیمی 

1. تک لایه سلولی از کشت های پایه که در محیط کشت استاندارد گسترش یافته را بررسی و مشاهده کنید تا از کانفلونسی فاز رشدmid-log  (80-60 درصد) مطمئن شوید (توصیه می شود از محیط DMEM با شماره کاتالوگ BI-1004 که دارای مکمل FBS 10% با شماره کاتالوگ BI-1201 است استفاده شود). محیط و سلول های شناور را از فلاسک کشت برداشته و دور بریزید. اجازه ندهید که سلول های بنیادی مزانشیمی پاساژ داده شده به طور کامل کانفلوانت شوند، زیرا می تواند قابلیت مولتی پتانسیل آنها را کاهش دهد.
2. به میزان 10-5 میلی لیتر PBS فاقد فسفر و منیزیم با شماره کاتالوگBI-1401 اضافه کنید. تک لایه سلولی را به آرامی شستشو دهید.
3. PBS فاقد فسفر و منیزیم را بردارید، به مقدار کافی از تریپسین پیش گرم شده (BI-1603 یا BI-1604) را به فلاسک اضافه کنید و بطور کامل سطح کشت را پوشش دهید. به مدت 5 تا 8 دقيقه يا تا زماني كه سلول ها به طور كامل جدا شوند در 36 تا 38 درجه سانتيگراد انكوبه كنید. استفاده بیش از حد از تريپسين منجر به کاهش بقا و توسعه سلول های بنیادی مزانشیمی می شود.
4. سلول های جدا شده را به آرامی به داخل یک محلول سلولی تکی پیپت کنید و با میکروسکوپ معکوس بررسی و تایید کنید.
5. سوسپانسیون سلولی را از فلاسک خارج و به یک لوله سانتریفوژ منتقل کنید.
6. سلول ها را در g 100 به مدت 5 تا 10 دقیقه سانتریفوژ کرده و رسوب دهید.
7. میزان حیات و نیز تراکم کلی سلول ها را با استفاده از رنگ آمیزی تریپان بلو (BI-1803) تعیین کنید.
8. دوباره رسوب را در یک حجم مناسب از محیط رشد سلول های بنیادی مزانشیمی که از قبل گرم شده است حل کنید (DMEM + 10% FBS توصیه می شود).
9. سلول ها را در محيط رشد سلول های بنیادی مزانشیمی در 36 تا 38 درجه سانتي گراد در مجاورت رطوبت و 6-4 درصد CO2 براي حداقل 2 ساعت تا حداکثر 4روز انکوبه کنید. پلیت ها را در پاساژ فلاسک T25 با تعداد تقریبا 1 x 10⁴ سلول در سانتی متر مربع برای سلول های با پاساژ کم یا 2 x 10⁴ سلول در سانتی متر مربع در مورد سلول های با پاساژ زیاد، در محیط رشد استاندارد تلقیح کنید (DMEM + 10% FBS توصیه می شود). سلول های بنیادی مزانشیمی که بطور مستمر پاساژ داده شده اند، بعد از پاساژ 10، بتدریج توانایی مالتی پتانسیل خود را از دست خواهد داد. یکی از مقادیر و پلیت های زیر را استفاده کنید:

نکته: برای آزمون اسپکتروفتومتری، سه چاهک را برای بلانک خالی بگذارید و سه چاهک از هر سویه ASC باید در محیط غیرالقا شده تست شود.

تمایز استئوژنز

1. هر روز سلول ها را بررسی کنید تا از وجود کانفلونسی فاز رشد mid-log (80-60 درصد) مطمئن شوید.  یا فقط با هم ادغام شوند، کل محیط کشت را برداشته و چاهک های تکرار شده را با محیط استئوپلاس (BI-1102) از پیش گرم شده و با محیط کنترل جایگزین کرده و انکوباسیون را ادامه دهید. سلول های بنیادی مزانشیمی همچنانکه در شرایط استئوژنیک تمایز می یابند به گسترش محدود خود ادامه می دهند،. هر 3 تا 4روز، کشت ها را دوباره غنی کنید. گسترش سلول های بنیادی مزانشیمی در محیط رشد برای 4-2 روز قبل از غنی کردن مجدد محیط استئوپلاس، می تواند فرایند استئوژنز را افزایش دهد.
2. پس از دوره های اختصاصی کشت، کشت های استئوژنیک را می توان با رنگ آلیزارین (BI-1801) پروسس کرد، از 14-7روز، آنالیز بیان ژن، یا تشخیص پروتئین استفاده کرد.

توجه: برخی از سویه های سلولی ممکن است به رشد خود ادامه دهند و در این شرایط به تراکم بیش از حد (نقطه ای که تک لایه سلولی کلامپ یا کنده شود) برسند.

توجه: برخی از کشت ها نسبت به سایرین، با سرعت کمتری کریستال انباشته می کنند. اگر به نظر می رسد کشت تمایز یافته است اما پس از 2 هفته هنوز کریستال ها کوچک هستند، کشت را باید با محیط تازه استئوپلاس غنی کرده و برای 4 روز دیگر به انکوباسیون را ادامه داد (در کل 21 روز در شرایط استئوژنیک). پس از  6 روز انکوباسیون در محیط تمایزی، کریستال های کلسیم قابل رویت خواهد بود.

3. سپس سلول ها را یکبار با PBS فاقد کلسیم منیزیم سرد شستشو دهید. اگر از اسلایدهای کشت 2 چاهکی استفاده می شود، محیط را خارج کنید و 2 میلی لیتر PBS فاقد کلسیم منیزیم سرد برای هر چاهک، یا 1 میلی لیتر برای پلیت های 12 چاهکی و 24 چاهکی اضافه کنید (از این حجم ها در تمام مراحل زیر استفاده کنید).
4. محلول شستشو را بردارید و محلول فرمالدهید/کلسیم را برای حداقل10 دقیقه در دمای اتاق، یا حداکثر 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد اضافه کنید.

اگر رنگ آمیزی آلیزارین رد تا این زمان انجام نشده است، فیکساتیو را بردارید، با PBS سرد جایگزین کرده و در دمای 4 درجه سانتی گراد برای حداکثر یک هفته نگهداری کنید تا آماده رنگ آمیزی بماند.