توضیحات

پرایمر Primer یا الیگونوکلئوتید Oligo nucleotide در زبان فارسی به معنای آغازگر می‌باشد که در زیست شناسی مولکولی به رشته‌ای از نوکلئیک اسید گفته می‌شود که برای آغاز همانندسازی DNA/RNA به‌کار می‌رود. جهت کارهای تحقیقاتی معمولاً بصورت سفارش سنتز توالی آماده می‌شوند. اما جهت برخی از کارهای تشخیصی و تحقیقاتی نیز پرایمرهای آماده مانند پرایمر JOE که اختصاصی توالی ویژه ای می‌باشد استفاده می‌شود.

4،5-دی کلرو-دی متوکسی فلورسین (JOE) یک نسخه دی کلره و دی متوکسیل شده از رنگ فلورسنت فلورسین است و برای برچسب زدن الیگونوکلئوتیدها در انتهای 5 یا 3 از طریق یک استر NHS استفاده می شود. JOE دارای حداکثر جذب 520 نانومتر و حداکثر انتشار 548 نانومتر است. JOE می تواند در کاربردهای PCR بلادرنگ به عنوان بخش گزارشگر در پروب های TaqMan، پرایمرهای Scorpion و Molecular Beacons استفاده شود. JOE معمولاً با خاموش کننده BHQ-1 جفت می شود، زیرا این دو دارای همپوشانی عالی هستند. پرایمرهای نشاندار شده با JOE نیز برای ژنوتیپ SNP باکتریایی توسط PCR بلادرنگ اختصاصی آلل استفاده میشوند.

ساختار پرایمر از تکرار بازهای آدنین، گوانین، سیتوزین و تیمین می باشد. توالی پرایمر Forward باید شبیه به ´ 5 ژن مورد نظر و توالی پرایمر Reverse مکمل معکوس انتهایˊ3 ژن می باشد.

تعیین طول آغازگر، یک فاکتور بسیار موثر در واکنش PCR محسوب می‌شود. طول مناسب آغازگر باید بین 18 تا  26 نوکلئوتید باشد. هر چند گاهی به علت متفاوت بودن درصد (GC Content) GC در دو طرف ژن، طول آغازگرها را حتی تا 50 نوکلئوتید افزایش می‌دهند و یا خیلی کوتاه می‌کنند. همچنین در هنگام طراحی آغازگر، باید به این نکته
توجه نمود که تفاوت طول پرایمر رفت و برگشت بهتر است بیش از سه نوکلئوتید در نظر گرفته نشود.

دمای ذوب (TM) دمایی است که در آن نیمی از آغازگرها به منطقه هدف می‌چسبند و این دما می‌تواند بهعنوان
شاخصی از دمای مرحله اتصال (Annealing Step) در PCR در نظر گرفته شود. دمای اتصال برای یک جفت آغازگر در یک واکنش PCR به طور معمول 50 تا 62 درجه سانتیگراد در نظر گرفته می‌شود.

کلید موفقیت در فرآیند PCR طراحی و ساخت یک آغازگر مناسب است. دانستن نکات لازم در رابطه با ساخت آغازگر، امری مهم تلقی می‌شود. پارامترهای گوناگونی بر روی کیفیت آغازگر تاثیر گذارند که از مهم‌ترین این موارد می‌توان به طول آغازگر، دمای ذوب، میزان GC، انتهایˊ 3 آغازگر، انتهایˊ 5 آغازگر، تشکیل آغازگردایمر، تشکیل حلقه و ساختارهای سنجاق سری اشاره نمود. پس از طراحی توالی آغازگر، با نرم افزارهای مختلف، می‌توان بصورت دستی این موارد را در حالت بهینه تنظیم کرد.

معرفی تامیین کنندگان پرایمر JOE

در حال حاضر پرایمر JOE از برند سیناکلون موجود می‌باشد. جهت استعلام سایر برندهای ایرانی و وارداتی این محصول با شرکت تماس بگیرید.

شرایط نگهداری پرایمر JOE

پرایمر JOE بصورت لیوفیلیزه می‌باشد و در دمای اتاق نگهداری می‌شود. اما پس از رقیق سازی آن باید در 20- نگهداری شود.

نکات مهم در طراحی پرایمر

• دو پرایمر، می‌بایست Tmهای یکسان یا مشابه داشته باشند و این دما، باید ترجیحاً از Tm رشته الگو بیشتر باشد (تا در دمایی که رشته الگو هنوز تک‌رشته‌ای است، پرایمرها به مکمل خود متصل شوند).

• پرایمرها باید در هیچ یک از دو انتهای 5′یا 3′، یا دست کم در سر 3′ دارای ساختارهای ثانویه نباشند و دیمر تشکیل ندهند. در صورت وجود چنین ساختارهایی به G△ آن توجه شود.
•  از آنجا که انتهای 3′پرایمر، گروه هیدروکسیل آزاد را در اختیار آنزیم پلیمراز قرار می‌دهد، در طراحی پرایمر، این بخش، در مقایسه با 5′ همواره اهمیت بیشتری دارد.

• نوکلئوتیدها باید به طور کلی، از پراکنش یکسانی در طول پرایمر برخوردار باشند. اما ترجیحاً سر 3′ غنی از GC (یا GC-Rich) باشد تا اتصالات محکم‌تری را با الگو برقرار کند.
• پرایمرها، ترجیحاً نباید در هیچ بخشی از توالی‌شان با خود یا پرایمر دیگر، مکمل باشند تا از ایجاد دیمرهای پرایمری جلوگیری شود.
• برای جلوگیری از تشکیل باندهای غیراختصاصی، پرایمرها ترجیحا نباید در هیچ بخشی از توالی خود، با بخش‌های دیگری از محتویات دربرگیرنده الگو، مکمل باشند. در صورت وجود چنین ساختارهایی به G△ آن توجه شود.
• احتمال تشکیل باندهای غیراختصاصی و دیمرهای پرایمری را می‌توان با انجام BLAST در پایگاه NCBI بررسی کرد.