اساس آزمایش در این کیت بر روش  Sandwich Enzyme Immunoassay دومرحله‌ای استوار است. در مرحله اول  HBs Agم موجود در نمونه به طور هم‌زمان با آنتی‌بادی‌های منوکلونال و پلی‌کلونال کوت شده در چاهک‌ها و آنتی‌بادی ضد  HBsAg نشان‌دار شده با بیوتین کنژوگه ۱ واکنش می‌دهد. پس از طی زمان انکوباسیون در مرحله دوم با افزودن کنژوگه حاوی کمپلکس استرپتاویدین – پراکسیداز کنژوگه ۲ استرپتاویدین به بیوتین موجود در کنژوگه اول متصل می‌گردد. پس از انکوباسیون و شستشو محلول سوبسترا و کروموژن به چاهک‌ها اضافه می‌شود.

رنگ آبی ایجاد شده بعدازاین مرحله نتیجه تجزیه سوبسترا در اثر فعالیت آنزیم و تغییر رنگ محلول کروموژن ناشی از این واکنش است. شدت این رنگ متناسب با تعداد کمپلکس‌های ایمنی ایجاد شده در چاهک‌ها می‌باشد. با افزودن محلول متوقف‌کننده، رنگ آبی به زرد تبدیل می‌شود که بهترین جذب نوری را در طول موج  ۴۵۰ نانومتر دارد.

محتویات کیت الایزا HBs-Ag پیشتاز طب

1. پلیت  ۹۶ خانه حاوی چاهک‌های پوشش داده شده با دو آنتی‌بادی منوکلونال و پلی‌کلونال علیه .HBs Ag
2. محلول کونژوگه : (Conjugate1) 1 آنتی‌بادی منوکلونال نشان‌دار با بیوتین در محلول بافری به رنگ قرمز حاوی پروتئین و نگهدارنده، یک ویال حاوی ۳/۵میلی‌لیتر. این محلول آماده مصرف می‌باشد.
3.  محلول کونژوگه: (Conjugate2) 2 استرپتاویدین – پراکسیداز در محلول بافری به رنگ آبی حاوی پروتئین و نگهدارنده. یک ویال حاوی ۳/۵میلی‌لیتر. این محلول آماده مصرف می‌باشد.
4.  سرم کنترل مثبت: (Positive Control)حاوی ۲ ml محلول بافری به رنگ بنفش دارای پروتئین به‌عنوان پایدارکننده و  %۰/۰۵کاتن به‌عنوان ماده محافظ و سرم انسانی غیرفعال شده دارای آنتی‌ژن HBsAg
5.  سرم کنترل منفی: (Negative Control)حاوی  ۳ ml محلول بافری به رنگ زرد و  %۰/۰۵کاتن به‌عنوان ماده محافظ و سرم انسانی منفی از نظر.HBsAg
6.  محلول رنگ‌زای یک‌مرحله‌ای: (Chromogen-Substrate)حاوی تترا متیل بنزیدین و آب‌اکسیژنه،  ۱ ویال محتوی ۱۲ میلی‌لیتر آماده برای مصرف .
7.  محلول شستشو Wash Buffer: محلول بافر فسفات و  %۰/۰۵توئین، یک ویال حاوی ۵۰ میلی‌لیتر محلول شستشوی غلیظ ۱۰ (X جهت تهیه محلول شستشوی آماده مصرف، مقدار موردنیاز را با آب مقطر به نسبت ۱/۱۰رقیق نمایید .
8.  محلول متوقف‌کننده: (Stop Solution) اسیدکلریدریک ۱ نرمال، یک ویال محتوی ۶ میلی‌لیتر .
9.  برچسب مخصوص پلیت.

نکات قابل‌ذکر برای مصرف‌کنندگان کیت الایزا HBs-Ag پیشتازطب

۱- محتویات این کیت تنها برای مصرف در همین کیت قابل‌استفاده هستند.
۲- این کیت صرفاً جهت تعیین  HBsAg در سرم و پلاسمای انسانی طراحی و ساخته شده است از مخلوط کردن نمونه‌های سرم پرهیز نمایید .
۳- از مخلوط کردن محتویات کیت‌ها با شماره ساخته‌ای مختلف جداً خودداری نمایید.
۴- کلیه مواد موجود در کیت که منشأ سرمی دارند از نظر وجود آنتی‌ژن  HIV و آنتی‌بادی‌های  HIV و  HCV کنترل گردیده و فاقد این عوامل می‌باشند. جهت احتیاط بهتر است کاربرانی که با کیت کار می‌کنند از تماس مستقیم با مواد بپرهیزند.
۵- هنگام انجام آزمایش حتماً از دستکش‌های یکبار مصرف استفاده کنید. همچنین استفاده از عینک‌های آزمایشگاهی هنگام کار با سرم‌های بیماران توصیه می‌شود.
۶- سرم‌های مثبت از نظر، HBsAg وسایل و محلول‌های شستشو مشکوک به آلودگی را بعد از اتمام کار به مدت حداقل ۳۰ دقیقه در مجاورت محلول هیپوکلریت سدیم  %۵ یا محلول‌های مناسب ضدعفونی‌کننده دیگر قرار دهید. همچنین اتوکلاو کردن به مدت  ۲۰ دقیقه در  ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد نیز پیشنهاد می‌گردد .

هشدارهای توصیه‌ای:

از این کیت فقط در مقاصد تشخیصی استفاده شود. این کیت برای مقاصد غربالگری تولید نشده است.

شرایط نگهداری

1. کیت را در یخچال بین دمای  ۲ تا  ۸ درجه سانتی‌گراد نگهداری نمایید .
2. چاهک‌ها را در کیسه مخصوص پلیت همراه با نمگیر نگهداری نمایید .
3. پایداری محتویات کیت قبل از باز شدن درب کیت. تا پایان مدت انقضا درج شده بر روی هر یک از آنها می‌باشد .
4. محلول شستشو را به نسبت ۱/۱۰با آب مقطر رقیق نمایید. این محلول (آماده مصرف) به مدت یک هفته در شرایط  ۲ – ۸ درجه سانتیگراد قابل نگهداری و مصرف می‌باشد. ممکن است در محلول شستشوی غلیظ کریستال تشکیل شود که این امر مشکلی را ایجاد نمی‌نماید. قبل از تهیه محلول شستشوی کار برای حل شدن کریستال‌ها ویال را در ۳۷ درجه سانتی‌گراد قرار دهید.

جمع‌آوری و آماده‌سازی نمونه

سرم و یا پلاسمای دارای  EDTA را می‌توان پس از جدا نمودن از سلول‌های خون استفاده نمود. اما از سرم یا پلاسمای رقیق شده یا  Pooled با نمونه‌های دیگر نباید استفاده کرد. نمونه را می‌توان به مدت یک هفته در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد و یا برای مدت‌زمان طولانی تر در دمای  -۲۰ درجه سانتی‌گراد نگهداری نمود (در ضمن باید از Freeze-thaw نمودن نمونه پرهیز شود). وجود آلودگی میکروبی، کدورت، همولیز، لیپمی و زردی در نمونه، ممکن است موجب تداخل در نتیجه نهایی آزمایش گردد.

توضیحات عمومی کیت الایزا HBs-Ag پیشتازطب

• قبل از شروع مراحل آزمایش تمام مواد و نمونه‌ها را به درجه حرارت اتاق برسانید. جهت ماندگاری بهتر پلیت، پلیت را بعد از رسیدن به دمای محیط از کیسه مخصوص آن خارج کرده و چاهک‌های موردنیاز را بردار
•  بهتر است به‌محض شروع آزمایش کلیه مراحل بدون توقف انجام‌پذیرند .
• از نوک سمپلر یک‌بارمصرف برای هر نمونه استفاده کنید .
•  پس از افزودن محلول متوقف‌کننده، جذب نوری چاهک‌ها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت می‌باشد .
•  برای کسب نتایج مطلوب باید شستشوی چاهک‌ها به‌صورت کامل صورت‌گرفته و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهک‌ها تخلیه شوند .
•  از مهم‌ترین فاکتورها در حصول نتیجه مطلوب، زمان مناسب انکوباسیون می‌باشد؛ بنابراین پیشنهاد می‌گردد قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلول‌های موردنیاز را آماده نموده و درب محلول‌های موردنیاز را باز کنید، این عمل با کاهش فاصله زمانی بین مراحل سمپلینگ باعث نتایج مطلوب‌تری می‌شود.