کیت سنجش MTT سیب زیست

دامنه کاربرد کیت سنجش MTT :

روش‌های مختلفی برای سنجش قابلیت حیات سلول وجود دارد که بر اساس انواع عملکردهای سلول مانند فعالیت آنزیمی، نفوذپذیری غشاء سلولی، تولید ATP ،تولید کوآنزیم و فعالیت جذب نوکلئوتید طراحی شده است. در این میان MTT یکی از پرکاربردترین روش‌های رنگ‌سنجی، بر مبنای فعالیت آنزیمی برای سنجش قابلیت حیات سلول‌ها است و به طور گسترده برای بررسی توان القا یا مهار تکثیر انواع داروها، سایتوکاین‌ها، فاکتورهای رشد، میتوژن‌ها و سایر تیمارها را در in vitro مورداستفاده قرار گرفته است.

برای مشاهده پروتکل MTT اینجا کلیک کنید

اساس سنجش تکثیر سلول به روش MTT:

معرف MTT نمک زردرنگ تترازولیوم با بار مثبت است که از طریق غشای سیتوپلاسمی وارد سلول می‌شود و توسط H)P(NAD –اکسیدوردوکتازهای داخل سلولی احیا شده و کریستال‌های فورمازان بنفش رنگ تشکیل می‌دهد. تشکیل کریستال‌های بنفش رنگ با فعالیت این آنزیم‌ها رابطه مستقیم دارد که به قابلیت حیات سلول نسبت داده می‌شود. کریستال‌های فرمازان به‌آسانی در DMSO حل می‌شود و اندازه‌گیری جذب در ۵۷۰ نانومتر می‌توان تأثیر تیمار دارویی را بر القا یا مهار رشد سلول محاسبه کرد.

مواد و وسایل موردنیاز:

۱ سمپلر و سرسمپلر برای حجم‌های ۱۰ تا ۱۰۰۰ میکرولیتر
۲ دستگاه میکروپلیت ریدر مجهز به فیلتر ۵۷۰ نانومتر و پلیت متناسب با دستگاه

روش انجام آزمایش

۱ سلول‌ها را بسته به اندازه‌های که دارند، به تعداد ۵۰۰ تا ۱۰۰۰۰۰ سلول در هر ۱۰۰ میلی‌لیتر، در هر چاهک پلیت ۹۶ خانه مخصوص کشت سلول بریزید. پلیت را در انکوباتور (CO2٪ ۵ ) با دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۷۲ ساعت نگهداری کنید. (این زمان می‌تواند بسته به نوع بررسی شما و قدرت تکثیر سلول کاهش یا افزایش یابد).
• بهتر است علاوه بر سلول‌های تحت تیمار، سلول‌های تیمار نشده و چاهک فاقد سلول هم به‌عنوان کنترل داشته باشید.

۲ برای آماده‌کردن معرف، ویال حاوی محلول MTT را از فریزر خارج کنید و در تاریکی در دمای اتاق قرار دهید تا ذوب شود. سپس به‌آرامی تکان دهید تا محلول یکنواخت شود.
• توجه کنید که هر ویال از MTT برای ۱۰۰ تست معادل یک پلیت ۹۶ خانه در نظر گرفته شده است.
۳ با استفاده از سمپلر، ۱۰ میکرولیتر از محلول MTT را به هر چاهک اضافه کنید و با دست یا روی شیکر به‌آرامی حرکت دهید تا یکنواخت شود.
• توجه کنید که هر ۱۰ میکرولیتر MTT باید به ۱۰۰ میکرولیتر مایع رویی کشت سلول اضافه شود. چنانچه از حجم‌های بیشتر یا ظروف کشت بزرگ‌تر از پلیت ۹۶ خانه استفاده می‌کنید باید حجم متناسب با حجم مایع رویی کشت سلول اضافه کنید.

۴ پلیت را ۴ تا ۶ ساعت در انکوباتور )CO2٪ ۵ ) با دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قرار دهید.

۵ در سلول‌های چسبیده مایع رویی سلول‌ها را کاملاً و به‌آرامی بکشید. به‌گونه‌ای که سلول‌ها از ته پلیت کنده نشود. در مورد سلول‌های معلق، می‌توانید پلیت را به مدت ۱۰ دقیقه و در g×۴۰۰ سانتریفیوژ کنید یا صبر کنید سلول‌ها خوب ته‌نشین شود و سپس مایع رویی را به‌آرامی بردارید.
۶ به هر چاهک ۱۰۰ میکرولیتر DMSO اضافه کنید و صبر کنید تا
کریستال‌های فورمازان حل شود و محلول صورتی – بنفش به وجود آید. چنانچه
کریستال‌ها زیاد بود برای یکنواخت شدن رنگ و حل شدن کامل کریستال‌ها
می‌توانید از پیپت کردن کمک بگیرید.
• توجه داشته باشید که پس از حل شدن باید بلافاصله جذب را بخوانید.
در غیر این صورت در حضور نور، رنگ محلول تغییر خواهد کرد.
۷ با استفاده از میکروپلیت ریدر، جذب نمونه‌ها را در ۵۷۰ نانومتر بخوانید.