محیط کشت شکلات آگار – Chocolate

محیط کشت میکروبی شکلات آگار که به نام محیط کشت Chocolate Agar Base نیز شناخته می‌شود. شکلات آگار بیس به سبب لیز شدن گلبول‌های قرمز خون به رنگ قهوه‌ای دیده می‌شود که بدین دلیل شکلات اگار خوانده می‌شود. لیز شدن RBCها طی فرایند حرارت دادن، باعث آزادشدن کوآنزیم داخل سلولی ” نیکوتینامید آدنین دی نوکلئوتید (Nicotinamide adenine dinucleotide) یا (فاکتور ۵ یا NAD) می‌شود که در محیط این محیط برای مصرف باکتری‌های فستیدیوس استفاده می‌شود. شکلات آگار، محیط پیچیده‌ای است که نیازهای غذایی پیچیده میکروارگانیسم‌ها را برطرف می‌کند.

محیط کشت شکلات آگار، محیطی غیرانتخابی و غیر افتراقی می‌باشد و به علت سالم نبودن سلول RBC بررسی همولیز در این محیط امکان‌پذیر نمی‌باشد. شایع‌ترین گونه‌های مورداستفاده برای این محیط غنی شده شامل این میکروارگانیسم‌ها می‌شود، نیسریا گونوره، نیسریا مننژیدیس، هموفیلوس آنفولانزا است که هیچ‌کدام از این‌گونه‌ها در بلاد اگار قادر به رشد نیستند. شکلات اگار محیط مناسبی برای میکروارگانیسم‌هایی است که تنها در صورت وجود مواد مغذی در محیط رشد می‌کنند مثل هموفیلوس آنفولانزا که در دمای ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتیگراد و در محیطی با ۵% دی‌اکسیدکربن انکوبه شود استفاده می‌شود.

فرمولاسیون محیط Chocolate Agar Base

طرز تهیه کلی محیط‌های کشت

همان‌طوری که می‌دانید محیط‌های کشت به سه دسته جامد، نیمه جامد، مایع تقسیم می‌شوند. محیط‌های مایع معمولاً فاقد آگار هستند یا مقدار آگارشان بسیار کم است. مثلاً حدود (۲/۰%) و محیط‌های نیمه جامد دارای مقدار کمی آگار حدود ۳- ۲ گرم و بالاخره محیط‌های جامد که دارای ۱۵- ۱۳ گرم آگار در لیتر محیط هستند .

برای ساختن محیط‌های کشت باکتری، ما از پودر مخصوص که در شیشه‌های مربوطه قرار دارد، استفاده می‌کنیم. در روی این شیشه‌ها ترکیب محیط به طور کامل و همچنین طرز ساختن آن نوشته شده است. مثلاً برای ساختن نوترینت آگار ابتدا مقدار لازم از پودر آن را وزن کرده و در مقدار معینی آب مقطر که قبلاً در یک ارلن مایر یا بطری ریخته‌اید اضافی نموده و آن را کاملاً حل نمایید و سپس با پنبه درب ارلن مایر را مسدود کرده و آن را روی سه‌پایه چراغ گازی حرارت می‌دهید، تا زمان جوشیدن آن را چند بار تکان دهید تا خوب حل شود و به مدت یک دقیقه بجوشد پس از آنکه مایع بجوش آمد، آن را برداشته وبا تکه کاغذ آلومینیومی روی پنبه را می‌پوشانید و ظرف را در اتوکلاو می‌گذارید تا در فشار ۱۵ پاند بر اینچ مربع و حرارت ۱۲۱ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه استریل شود. بعد از استریل کردن بگذارید تا خنک شود تا حدود c45⁰– 40 . سپس درحالی‌که ارلن را در دست راست گرفته و پنبه آن را با دست چپ کنار شعله خارج کرده‌اید، دهانه ارلن را یکبار از درون شعله گاز عبور دهید و بعد درون پلیت‌های استریل شده بین ^cc20- 15 از محل محلول بریزید . بعد پلیت‌ها را در کناری بگذارید تا سرد شوند و از تکان دادن آن خودداری نمایید و پس از جامد شدن محیط‌های کشت نوترینت آگار را جمع کرده و در c37⁰ به مدت ۲۴ ساعت قرار دهید. اگر محیط‌ها آلوده نشده باشند آنها را از c37⁰ بیرون آورده و در یخچال ۴ درجه سانتی‌گراد قرار می‌دهید. طرز ساختن سایر محیط‌های کشت، همین‌طور می‌باشد منتهی بعضی از محیط‌های جامد در لوله مستقیم، پس از جوشاندن ریخته شده و بعد استریل می‌شوند که این محیط‌ها را پس از استریل شدن، به طور ایستاده می‌گذاریم مثل محیط SIM و یا کج می‌گذاریم مثل محیط TSI تا سرد شوند. برای ساختن محیط مایع (براث) پس از جوشاندن، محیط را در لوله‌ها تقسیم می‌کنیم و سپس با پنبه‌ای درب آنها را مسدود کرده و جهت استریل داخل اتوکلاو قرار می‌دهیم.