توضیحات

ویژگی ها و کاربرد های کیت سنجش MTT ایده زیست

یک کیت حساس برای اندازه گیری تکثیر سلولی بر پایه احیای MTT است. اساس این تست، احیای MTT به ماده رنگی نامحلول فرمازان از فعالیت گلیکولیتیک در داخل سلول است و به حضور NADH وNADPH بستگی دارد (بنابراین با فعالیت متابولیک میتوکندری ارتباط دارد). در سلول های بطور فعال تکثیرشونده، افزایش تبدیلMTT از طریق اسپکتروفوتومتر اندازه گیری می شود.

مقایسه این مقدار با مقدار بدست آمده از یک کنترل فاقد تیمار، باعث افزایش نسبی تکثیر سلولی می شود که ناشی از فاکتورهای تروفیک، مهارکننده های رشد، یا القا کننده ها /مهارکننده های آپوپتوزیس بوده و قابل اندازه گیری است. بطور معکوس، در سلول هایی که دچار آپوپتوزیس می شوند، احیای MTT کاهش می یابد که بیانگر مرگ سلولی است.

محتویات کیت MTT Assay

1. پودر :MTT یک ویال حاوی 25 میلی گرم پودر MTT
2. حلال: یک بطری حاوی 30 میلی لیتر محلول DMSO
3. فیلترسرنگی: 1 عدد
4. میکروتیوب امبر: 5 عدد
5. محیط RPMI 1640: 100 میلی لیتر محلول آماده مصرف

آماده سازی محلولهای کیت MTT Assay

• با افزودن 5 میلی لیتر از محیط RPMI1640 (موجود در کیت) به ویال 25 میلی گرمی پودر MTT، محلول استوک MTT 12 میلی مولار بسازید.
• با ورتکس یا سونیکاسیون مخلوط کنید تا حل شود.
• پارتیکل ها را از طریق فیلتراسیون یا سانتریفوژ حذف کنید.
• از محلول آماده شده به میزان برابر در 5 ویال امبر تقسیم کنید.
• هر ویالMTT معرف لازم برای 100 تست را دارد (10 لاندا از محلول استوک برای هر چاهک).
• پس از تهیه، محلول کاری MTT را می توان برای 4 هفته در 4 درجه سانتیگراد و دور از نور نگهداری کرد. مابقی استوک ها را در -20 درجه نگهداری کنید.

توصیه ها، نکات و روش استفاده از کیت سنجش MTT ایده زیست نوترکیب

برخی داروها و عصاره های گیاهی ممکن است با تست MTT تداخل کنند. قبل از آغاز آزمایش از این موضوع اطمینان حاصل کنید.

تعیین تعداد بهینه سلول

این کار برای هر نوع سلول تنها باید یکبار انجام شود.

تلقیح اولیه سلول

• سلول ها تا تقریبا 80 درصد کانفلوانسی در یک فلاسک یا پلیت کشت سلولی کشت دهید.

توجه: برای دستیابی به نتایج بهتر، از تعداد پاساژ کم استفاده کنید.

• سلول های معلق را با سانتریفوژ جمع کنید (5 دقیقه در 200g). سلول های چسبیده باید بوسیله ترپسینه کردن یا تراشیدن از سوبسترای خود آزاد شوند. سپس، با سانتریفوژ به مدت 5 دقیقه با دور 500g در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد، سلول ها را رسوب دهید و مایع رویی را دور بریزید.
• سلول ها را با سوسپانسه کردن مجدد در 5 میلی لیترBS  (فاقد کلسیم و منیزیم) یا محیط کشت سلولی شستشو دهید. سپس، با سانتریفوژ به مدت 5 دقیقه با دور 500g در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد، سلول ها را رسوب دهید و مایع رویی را دور بریزید.
• سلول ها را با غلظت10⁶ × 5 سلول در میلی لیتر در محیط کشت حل کنید. به اندازه ای سلول بردارید و شستشو دهید که بتوانید تعداد کافی سلول برای تهیه10-8 رقت دو برابر متوالی با حجم100 میکرولیتر سلول در هر چاهک در سه تکرار داشته باشید
• با استفاده از لوله های کشت 5 میلی لیتری، سلول ها را بصورت سریال رقیق کنید. رقت از 10⁶ × 5 تا 10³ × 5 سلول در میلی لیتر باید برای اکثر انواع سلول ها مناسب باشد. به عنوان مثال، 10رقت دو برابری از10⁶ × 5 سلول در میلی لیتر منجر به غلظت های از 10⁶ × 5/2 تا 10³ × 88/4 سلول در میلی لیتر می شود (به جدول زیر مراجعه کنید). برای این مورد، باید 8/0 میلی لیتر از سلول های با غلظت10⁶ × 5 سلول در میلی لیتر را برای رسیدن به تعداد 10⁶ × 4 سلول بردارید. به جدول مراجعه کنید.

سلول

• سلول ها را به اندازه 100 میکرولیتر در هر چاهک کشت دهید. سه چاهک کنترل تنها حاوی محیط کشت سلول باشد.

توجه: برای به حداقل رساندن edge effect، توصیه می شود که اولین و آخرین چاهک را با محیط کشت پر کنید تا رطوبت برای اولین و آخرین چاهک حفظ شود.

توجه: از پلیت 96 چاهک ته گرد برای سلول های غيرچسبیده به بستر و پلیت96 چاهک ته صاف برای سلول های چسبیده به بستر استفاده کنید.

• سلول ها را برای 6 تا 48 ساعت انکوبه کنید. سلول ها ریکاوری و اتصال مجدد به بستر (در صورت چسبنده بودن) به زمان نیاز دارند. این زمان برای هر نوع سلول متفاوت است. به طور کلی، 12 تا 18 ساعت کافی است.

روش رنگ آمیزی MTT

• 10 لاندا محلول استوک MTT به هر چاهک اضافه کنید.
• پلیت را 4-2 ساعت در 37 درجه انکوبه کنید. با استفاده از یک میکروسکوپ، بصورت مداوم سلول ها را برای بروز نقاط رسوب داخل سلولی بررسی کنید. برخی از انواع سلول ها به زمان بیشتری حتی تا 24 ساعت نیاز دارند.
• با مشاهده رسوب واضح ارغوانی زیر میکروسکوپ، 100 میکرولیتر معرف دترجنت (DMSO) به هر چاهک از جمله چاهک کنترل اضافه کنید. نیاز به برداشتن MTT یا محیط قبل از افزودن حلال نیست. به هیج وجه تکان ندهید (شیکینگ نکنید).
• پلیت را با کاور بپوشانید و برای دست کم 2 ساعت تا یک شبانه روز در 24-18 درجه سانتیگراد قرار دهید. می تواند جذب نمونه ها را پس از 2 ساعت قرائت کرد اما اگر جذب پایین بود و هنوز کریستال باقی مانده بود پلیت را به تاریکی برگردانده و برای مدت بیشتری انکوبه کنید. انکوباسیون در دمای اتاق (24-18 درجه) کافی است اما انکوباسیون در دمای 37 درجه زمان حل شدن را کاهش می دهد.

جمع آوری داده، محاسبه و تفسیر 

• کاور روی پلیت را بردارید و جذب چاهک ها از جمله بلانک را در طول موج 570 نانومتر با طول موج رفرانس 650 نانومتر اندازه گیری کنید. اگر فیلتر 570 نانومتر در دسترس نبود، جذب می تواند با هر فیلتر دیگری در طول موج 550 تا 600 نانومتر خوانده شود. بلانک ها باید جذب نوری 01 بدهند.

• میانگین خوانش های سه گانه را تعیین کنید و آن را میانگین بدست آمده برای بلانک کم کنید. نمودار جذب در محور y را علیه تعداد سلول در میلی لیتر در محور x رسم کنید. تعداد سلولی انتخاب کنید که جذب 75/0 تا 25/1 داده و در ناحیه خطی منحنی قرار گیرد.

آزمون MTT برای نمونه های آزمایشگاهی

تلقیح اولیه سلول

• سلول ها را با غلظت بهینه تعیین شده در مرحله قبل کشت دهید. برای هر متغیر، سه چاهک، هر چاهک 100 میکرولیتر کشت دهید. مطمئن شوید که آنقدر چاهک کشت داده اید که کنترل های بر پایه سلول و سه چاهک برای محیط کشت خالی داشته باشید.

توجه: به طور کلی، سلول هایی که با تراکم 5000 تا 10،000 سلول در هر چاهک تلقیح شده اند ظرف 48- 72 ساعت به تراکم جمعیت مطلوب خواهند رسید.

• سلول ها را انکوبه کنید تا ریکاوری شده و دوباره به بستر متصل شوند (در صورت چسبنده بودن) و با توجه به پروتکل آزمایشگاهی ست آپ شده خود، آنها را تیمار کنید.

تیمار

• برای سلولهای چسبیده به بستر، محیط را بردارید، با PBS شستشو دهید و با محیط آماده مصرف RPMI1640 ( موجود در کیت) جایگزین کنید. در مورد سلول های غیرمتصل به بستر، میکروپلیت را سانتریفوژ کنید و سلول ها را رسوب دهید. با دقت و تا حد ممکن محیط را بردارید و آن را با 100 میلی لیتر محیط RPMI1640 جایگزین کنید.

توجه: حضور فنول قرمز در آزمایش نهایی بشدت بر نتایج تاثیر می گذارد. در صورت امکان اکیدا توصیه می شود سلول ها در محیط فاقد فنول قرمز (موجود در کیت) کشت شود.

• سلول ها را با غلظت های مختلف ترکیب مورد نظر برای 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور CO2 تیمار کنید.

رنگ آمیزی MTT

• 10 لاندا معرف MTT به هر چاهک از جمله چاهک های کنترل اضافه کنید.

توجه: اگر بیش از 100 میکرولیتر محیط کشت سلول برای هر چاهک استفاده شد میزان MTT را به همان نسبت افزایش دهید. برای مثال برای250 میکرولیتر محیط، 25 میکرولیتر معرف MTT استفاده کنید.

توجه: بطور جایگزین، انکوباسیون نهایی با MTT را می توان پس از تعویض سلول ها با یک محیط فاقد فنل رد انجام داد.

توجه: یک کنترل منفی آماده کنید (10 میکرولیتر از محلول استوک MTT اضافه شده به 100 میکرولیتر محیط خالی).

• پلیت را حدود 4-2 ساعت در 37 درجه انکوبه کنید. با استفاده از یک میکروسکوپ، بصورت مداوم سلول ها را برای بروز نقاط رسوب داخل سلولی بررسی کنید. برخی از انواع سلول ها به زمان بیشتری حتی تا 24 ساعت نیاز دارند. در غلظت های خیلی بالا (مانند بالاتر از 100 هزار سلول در هر چاهک) زمان انکوباسیون تا 2 ساعت کوتاه می شود.
• با مشاهده رسوب واضح ارغوانی زیر میکروسکوپ، 100 میکرولیتر معرف دترجنت (DMSO) به هر چاهک از جمله چاهک کنترل اضافه کنید. نیاز به برداشتن MTT یا محیط قبل از افزودن حلال نیست. به هیج وجه تکان ندهید (شیکینگ نکنید).
• پلیت را با کاور بپوشانید و برای دست کم 2 ساعت تا یک شبانه روز در 24-18 درجه سانتیگراد قرار دهید. می تواند جذب نمونه ها را پس از 2 ساعت قرائت کرد اما اگر جذب پایین بود و هنوز کریستال باقی مانده بود پلیت را به تاریکی برگردانده و برای مدت بیشتری انکوبه کنید. انکوباسیون در دمای تاق (24-18 درجه) کافی است اما انکوباسیون در دمای 37 درجه زمان حل شدن را کاهش می دهد.

• کاور روی پلیت را بردارید و جذب چاهک ها از جمله بلانک را در طول موج 570 نانومتر با طول موج رفرانس 650 نانومتر اندازه گیری کنید. اگر فیلتر 570 نانومتر در دسترس نبود، جذب می تواند با هر فیلتر دیگری در طول موج 550 تا 600 نانومتر خوانده شود. بلانک ها باید جذب نوری0 1 بدهند.

توجه: شما می توانید رنگ تبدیل شده را با 2 میلی لیتر ایزوپروپانول اسیدی حل کنید (اسید هیدروکلریک 04/0مولار در ایزوپروپانول مطلق با نسبت 100: 1)، بویژه زمانی که رنگ MTT تداخل با تیمار تداخل می کند. چندین بار پیپت کنید تا مطمئن شوید که رنگ تبدیل شده کاملا حل شده است. برای 30 دقيقه در 37 درجه سانتيگراد انكوبه كنید، به آرامی مخلوط كنید و به مدت 30 دقيقه در 37 درجه سانتيگراد انکوبه کنید.

جمع آوری داده، محاسبه و تفسیر نتایج کیت سنجش MTT ایده زیست نوترکیب

• میانگین خوانش های سه گانه را تعیین کنید و آن را میانگین بدست آمده برای بلانک کم کنید. نمودار جذب در محور y را علیه تعداد سلول در میلی لیتر در محور x رسم کنید. تعداد سلول انتخاب شده باید در ناحیه خطی منحنی قرار گیرد و جذب 75/0 تا 25/1 بدهد.

 توجه: شرایط کشت سلولی می تواند نتایج را تحت تأثیر قرار دهد و بنابراین در هنگام تجزیه و تحلیل داده ها باید مورد توجه قرار گیرد. عمر محیط کشت، تعداد پاساژ ها، و جزئیات محيط رشد هر يک مي تواند عامل مهمي باشد. بعلت اختلاف طبیعی در احتیاجات و سرعت رشد رده های سلولی مختلف، نمی توان دستورالعمل واحدی برای آماده سازی همه سلول ها فراهم کرد.

توجه: نمودار بدست آمده از روش اول (تعیین تعداد سلول بهینه) باید یک منحنی فراهم کند که دارای یک بخش خطی است. انتخاب تعداد سلولی که در بخش خطی منحنی قرار بگیرد (یعنی مقادیر بین 75/0تا 25/1) امکان اندازه گیری هم تحریک و هم مهار تکثیر سلولی را فراهم می کند.

توجه: اگر مقدار جذب نمونه های آزمایشگاهی بیشتر از سلول های کنترل منفی باشد، نشان دهنده افزایش تکثیر سلولی است. بطور جایگزین، اگر میزان جذب نمونه های آزمایشگاهی کمتر از کنترل منفی باشد، نشان دهنده کاهش میزان تکثیر سلولی یا کاهش میزان کلی حیات سلولی است.

توجه: در بعضی موارد نادر، افزایش تکثیر سلولی ممکن است با مرگ سلول جبران شود. بنابراین، علایم مرگ سلولی را می توان از تغییرات مورفولوژیکی استنباط کرد.

• مقادیر جذب کمتر از سلولهای کنترل نشان دهنده کاهش میزان تکثیر سلولی است. در مقابل، میزان جذب بالاتر نشان دهنده افزایش تکثیر سلولی است. به ندرت، ممکن است افزایش تکثیر با مرگ سلول جبران شود.

 شرایط بهینه نگهداری کیت سنجش MTT ایده زیست

پس از تحویل، کیت در 4 درجه سانتیگراد و دور از نور نگهداری شود. در صورت نگهداری صحیح، محتویات کیت برای 12 ماه پایدار می ماند.

کاتالوگ MTT Assay Kit

• دریافت کاتالوگ کیت سنجش MTT ایده زیست نوترکیب (فارسی)
• دریافت کاتالوگ کیت سنجش MTT ایده زیست نوترکیب (انگلیسی)

ارجاعات

1. Sattary, Mansoureh, et al. “Incorporation of nanohydroxyapatite and vitamin D3 into electrospun PCL/Gelatin scaffolds: The influence on the physical and chemical properties and cell behavior for bone tissue engineering.” Polymers for Advanced Technologies 29.1 (2018): 451-462.
2. Dianat, S., et al. “ctDNA binding affinity and in vitro antitumor activity of three Keggin type polyoxotungestates.” Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 124 (2013): 27-33.
3. Dianat, Somayeh, et al. “In vitro antitumor activity of free and nano-encapsulated Na5 [PMo10V2O40]· nH2O and its binding properties with ctDNA by using combined spectroscopic methods.” Journal of inorganic biochemistry 152 (2015): 74-81.
4. Poormontaseri, Maryam, et al. “The effects of probiotic Bacillus subtilis on the cytotoxicity of Clostridium perfringens type a in Caco-2 cell culture.” BMC microbiology 17.1 (2017): 150.
5. Amini-Sarteshnizi, Nematallah, et al. “Anticancer activity of ethanolic extract of propolis on AGS cell line.” Journal of HerbMed Pharmacology 4 (2015).
6. Simonian, Miganoosh, et al. “Evaluation of miR-21 Inhibition and its Impact on Cancer Susceptibility Candidate 2 Long Noncoding RNA in Colorectal Cancer Cell Line.” Advanced biomedical research 7 (2018).
7. Teimouri, Aref, et al. “Anti-Toxoplasma activity of various molecular weights and concentrations of chitosan nanoparticles on tachyzoites of RH strain.” International journal of nanomedicine 13 (2018): 1341.
8. Ebadi, Parimah, and Mehdi Fazeli. “Anti-photoaging potential of propolis extract in UVB-irradiated human dermal fibroblasts through increasing the expression of FOXO3A and NGF genes.” Biomedicine & Pharmacotherapy 95 (2017): 47-54.
9. Mohammadian-Hafshejani, A., et al. “In vitro evaluation of antiviral activity of essential oil from Zataria multiflora Boiss. against Newcastle disease virus.” Journal of HerbMed Pharmacology 4 (2015).
10. Nourmohammadi, Jhamak, et al. “Silk fibroin/kappa-carrageenan composite scaffolds with enhanced biomimetic mineralization for bone regeneration applications.” Materials Science and Engineering: C 76 (2017): 951-958.