تریپان بلو ایده زیست نوترکیب

ویژگی ها و کاربرد های تریپان بلو ایده زیست نوترکیب

تریپان بلو ایده زیست نوترکیب، یک نوع رنگ آزو است که از تولوئیدین مشتق می شود. این رنگ به نام های دیامین بلو و نیاگارا بلو هم شناخته می شود. تریپان بلو به عنوان یک رنگ حیاتی برای تمایز سلوهای زنده از سلول های غیر زنده بکار می رود. این رنگ بطور انتخابی بافت ها و سلول های مرده را به رنگ آبی در می آورد. بواسطه انتخابی بودن شدید غشا، سلول ها و بافت های زنده که غشاء سلولی آنها سالم است رنگ نمی گیرد، زیرا این رنگ نمی تواند از غشاء آنها عبور کرده و وارد آنها شود و بدین ترتیب تریپان بلو بوسیله سلول های زنده جذب نمی گردد.

در مقابل، این رنگ از غشاء سلولی سلول های مرده عبور کرده و سلول های مرده بعد از رنگ آمیزی با این رنگ در زیر میکروسکوپ به رنگ آبی (و قابل شمارش) دیده می شوند. از آنجاکه سلول های زنده رنگ نمی گیرند این روش تحت عنوان “Dye exclusion method” نیز شناخته می شود. تریپان بلو همچنین بطور شایعی برای شمارش سلولی با میکروسکوپ نیز بکار می رود. این محصول، محلول 4/0 درصد تریپان بلو در بافر فسفات سالین دالبکو است. به منظور حذف دبری ها، این محصول از فیلتر 2/0 میکرون عبور داده می شود.

• ظاهر: مایع آبی رنگ تیره
• پی اچ: 7.4 – 7.6
• استریلیته: تایید شده
• عمر مفید: 12 ماه
• نگهداری: 25-20 درجه سانتیگراد

روش استفاده از تریپان بلو ایده زیست نوترکیب

• یک سوسپانسیون معادل تقریبا 1 × 10⁶ cells/ml سلول در میلی لیتر آماده کنید. مطمئن شوید که نمونه بطور کامل مخلوط شده است.

توجه: سلول های متصل باید در ابتدا با تریپسین تیمار شوند تا یک سوسپانسیون سلولی ایجاد شود. غلظت 1 × 106 سلول در میلی لیتر منجر به میانگین 50 سلول در هر گوشه از گرید هوموسایتومتر می شود که یک تعداد سلول منطقی از نظر دقت و صحت است. غلظت کمتر از 1 × 10⁵ سلول در میلی لیتر، بسیار کمتر از حد لازم برای تولید یک تعداد دقیق سلولی است. این نمونه می تواند از طریق سانتریفوژ قبل از شمارش، تلغیط شود. غلظت1 × 10⁷ سلول در میلی لیتر، بسیار بیشتر از حد لازم برای شمارش دقیق است و باید قبل از شمارش رقیق شود.

• یک مخلوط 1:1 از سوسپانسیون سلولی و محلول تریپان بلو آماده کنید. جحم نمونه می تواند از 10 میلی لیتر تا چندین میلی لیتر باشد. به آرامی مخلوط کنید و بگذارید برای 5 دقیقه در دمای اتاق بماند.

توجه: جلوگیری از مرگ سلولی ناشی از سمیت تریپان بلو، نباید سلول ها بیش از 15 دقیقه در داخل تریپان بلو بماند.

توجه: تریپان بلو یک عامل موتاژن بالقوه است. با احتیاط با آن کار کنید و مطابق با دستورالعمل های استاندارد داخل سطل زباله ایمنی دور بریزید.

• قبل از استفاده، هوموسایتومتر را با اتانول 70 درصد بشویید و صبر کنید تا خشک شود.
• کاوراسلیپ را با اتانول 70 درصد بشویید و صبر کنید تا خشک شود. سپس آن را بالای اتاقک شمارش هوموسایتومتر قرار دهید.
• مقدار 15 میلی لیتر سوسپانسیون سلولی را روی لبه اتاقک شمارش بین کاوراسلیپ و شکاف V شکل در اتاقک شمارش قرار دهید. اجازه دهید سوسپانسیون سلولی با عمل کاپیلاری به داخل اتاقک شمارش کشیده شود.
• اجازه دهید 2-1 دقیقه بماند و سپس شمارش کنید.

توجه: اگر بیش از 10 درصد سلول ها کلاستر بنظر می رسند، کل فرایند را تکرار کنید تا مطمئن شوید از طریق پیپت کردن شدید در سوسپانسیون سلولی اولیه )همانند مخلوط سوسپانسیون سلولی تریپان بلو) سلول ها به خوبی از هم جدا شده اند. اگر کمتر از 200 یا بیشتر از 500 سلول (یعنی 50-20 سلول در هر مربع) در 10 مربع مشاهده شوند، فرایند را تکرار کنید تا یک فاکتور رقت مناسب بدست آید.

• درصد سلول های زنده را بر اساس فرمول زیر محاسبه کنید:

برای محاسیه تعداد کل سلول های زنده در هر میلی لیتر از الیکوت، تعداد کل سلول های زنده را در 2 ضرب کنید (فاکتور رقت تریپان بلو). برای بدست آوردن تعداد کل سلول ها در هر میلی لیتر از الیکوت، تعداد کل سلول های زنده و غیرزنده را با هم جمع کرده و سپس دو برابر کنید.