آنزیم کلاژناز Collagenase ایده زیست نوترکیب

ویژگی های آنزیم کلاژناز ایده زیست نوترکیب

کلاژناز (بدست آمده از کلستریدیوم هسیتولیتیکوم) یک آنزیم پروتئاز است که برای پیوند بین یک اسید آمینه خنثی (X) و گلیسین در توالی پرولین-X-گلیسین-پرولین اختصاصیت دارد. این توالی به کرات در کلاژن تکرار شده است و در بین پروتئازها از این نظر منحصر به فرد است که می تواند فیبریل های کلاژن طبیعی مارپیچ سه گانه (که بطور شایع در بافت یپوندی یافت می شود) را تخریب کند. کلاژناز خام معمولا حاوی کلستریدیوپپتیداز A و تعدادی از آنزیم های پروتئاز، پلی ساکاریداز و لیپاز بوده و بطور شایع برای تجزیه بافتی بکار می رود. این آنزیم خام برای تجزیه بافت ایده آل است زیرا علاوه بر داشتن آنزیم مورد نیاز برای تخریب کلاژن طبیعی و فیبرهای شبکه ای، حاوی آنزیم هایی است که سایر پروتئین ها، پلی ساکاریدها و لیپیدهای موجود در ماتریکس خارج سلولی بافت های پیوندی و اپیتلیال را هیدرولیز می کند.

کلاژناز چیست؟

کلاژنازها آنزیم های اندوپپتیدازی هستند که کلاژن را در ناحیه مارپیچ سه گانه تجزیه می کنند. کلاژن جزء فیبروز اصلی بافت همبند خارج سلولی حیوانات است. کلاژناز علاوه بر تولید توسط بعضی از باکتری ها، می تواند توسط بدن به عنوان بخشی از پاسخ ایمنی طبیعی نیز ساخته شود. کلاژناز معمولا بافت همبند را در سلول های عضلانی و دیگر اندام های بدن را هدف می گیرد. کلاژناز نوع I که توسط کلستریدیوم هسیتولیتیکوم ساخته می شود که دارای فعالیت ترپتیک بوده و برای جداسازی بافت بکار میرود…

انواع آنزیم کلاژناز

کلاژناز Type I: این نوع کلاژن در استخوان و وتر وجود دارد و از تعداد زیادی دسته‌های فیبری ساخته شده‌است که به صورت امواج دریا قرار دارند.

کلاژناز Type IV: کلاژن نوع IV در غشای پایه و نوع V در جدار رگ‌های خونی جنین یافت می‌شود.

پتانسیلیک واحد آنزیم، معادل یک میلی مول لوسین را ظرف 5 ساعت در 37 درجه سانتیگراد با pH 7.5 از کلاژن آزاد می کند. فعالیت محصول کلاژناز نوع 1 بالاتر از 125 واحد بر میلی گرم باشد.

روش استفاده از آنزیم کلاژناز ایده زیست نوترکیب

آماده سازی محلول استوک و محلول کاری
1. آنزیم لیوفیلیزه غیراستریل را در HBSS (حاوی کلسیم و منیزیم) یا PBS (حاوی کلسیم و منیزیم) یا DMEM/F12 حل کنید. محلول را توسط فیلتراسیون مخصوص کشت سلول استریل کنید. کلاژناز خام اغلب در غلظت های 1/0 تا 5/0 درصد (W / V) یا 50 تا 100 واحد بر میلی لیتر استفاده کنید. بلافاصله پس از تهیه، محلول را استفاده کنید یا در فریزر قرار دهید. بلافاصله قبل از استفاده، آن را در دمای یخجال ذوب کنید.
تجزیه بافت برای استفاده از آنزیم کلاژناز ایده زیست
1. بافت را با استفاده از یک اسکالپل یا قیچی استریل تکه تکه کنید.
2. بافت را چندین بار در HBSS بشویید.
3. قطعات بافت در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار دهید. با استفاده از یک سکوی غلتان و اضافه کردن CaCl2 3 میلی مولار، کارایی فرایند را افزایش دهید.

انتشار در ارگان
1. دایجست را تا 37 درجه سانتیگراد گرم کنید و انتشار در بافت در یک سرعت بهینه شده از قبل، برای ارگان مورد نظر انجام دهید. افزودن CaCl2 3 میلی مولار کارایی فرایند تجزیه را افزایش می دهد.
2. سلول های پراکنده و قطعات بافت با عبور دادن مخلوط از یک فولاد استریل زنگ نزن یا یک شبکه نایلونی، از قطعات بزرگتر جدا کنید. در صورتیکه نیاز به تجزیه بیشتر، می توان محلول کلاژناز تازه به قطعات اضافه کرد.
3. برا ی حذف دبری ها و محلول آنزیم، چندین بار شستشو انجام دهید. یک مرحله جداسازی دانسیته (نایکودنس) باعث ایجاد یک سوسپانسیون شفاف تر خواهد شد.
4. رسوب را در محیط کشت سوسپانسه و در شرایط تعیین شده از قبل انکوبه کنید.

نکات

در دمای 8-2 درجه سانتیگراد (5- تا 20- درجه سانتیگراد پس از آماده سازی) نگهداری کنید.
از رطوبت و تماس با نور پرهیز کنید.
از استنشاق و تماس با پوست اجتناب کنید.
فقط برای مقاصد تحقیقاتی استفاده شود. برای مقاصد تشخیصی یا درمانی در انسان یا حیوان مناسب نیست.
در مقایسه با سایر پرپوراسیون های کلاژناز، کلاژناز نوع 1 دارای سطوح متوسط فعالیت های کلاژناز، کازئیناز، کلوستریپاین، و تریپتیک است و به خوبی برای تجزیه بافت چربی، آدرنال، کبد، و اپی تلیال بهینه شده است.
عوامل شلاته کننده فلزات مانند سیستیئن، EDTA، و گونه فعال اکسیژن باعث مهار آن می شوند.

کاتالوگ

ارجاعات

Rajaei, Bahareh, et al. “Pancreatic Endoderm‐Derived From Diabetic Patient‐Specific Induced Pluripotent Stem Cell Generates Glucose‐Responsive Insulin‐Secreting Cells.” Journal of cellular physiology10 (2017): 2616-2625