آنتی‌بیوتیک‌ها جزء دسته‌ای بزرگ از داروها هستند که باعث متوقف کردن رشد باکتری‌ها (باکتریواستاتیک) یا از بین بردن باکتری‌ها (باکتریوسیدال) می‌شوند. هر دسته از آنتی‌بیوتیک‌ها بر روی باکتریهای خاصی تأثیر دارند و بر روی ویروس یا سایرمیکروارگانیسم‌ها تأثیری نخواهند داشت. برای اینکه بدانیم چه آنتی‌بیوتیکی بر روی چه باکتری‌هایی مؤثر است تست آنتی بیوگرام باید انجام ‌گیرد. این تست به ما نشان می‌دهد که کدام یک از آنتی‌بیوتیک‌ها بر روی کدام باکتری مؤثر است. نمونه‌های گرفته شده برای بخش میکروبیولوژی متفاوت هستند. اما نمونه‌ها هر چه که باشند(خون، csf، مدفوع، ادرار، خلط و …) در آخر معمولاً آنتی بیوگرام می‌شوند تا داروی مؤثر تجویز شود؛ و بهبودی سریعتر صورت گیرد.

اصول آنتی بیوگرام

اصول آنتی بیوگرام بر پایه دو اصطلاح میکروب‌شناسی است یعنی:

Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
Minimum Bactericidal Concentration (MBC)

اصطلاح MIC:مخفف عبارت Minimum Inhibitory Concentration بوده و بیانگر حداقل غلظتی از یک آنتی‌بیوتیک است که می‌تواند رشد باکتری را متوقف نماید(باکتری استاتیک).

اصطلاح MBC: همان Minimum Bactericidal Concentration می‌باشد و به معنای حداقل غلظتی از آنتی بیوتیک است که موجب مرگ باکتری می‌شود (باکتریوساید).

طرح شماتیک MIC و MBC

انواع روش‌های انجام تست آنتی بیوگرام (حساسیت دارویی) :

Disk diffusion (Kirby Bauer)
Broth micro-dilution MIC (NCCS) متد رفرنس
Etest

که ساده‌ترین و متداول‌ترین روش همان روش DISK diffusion می‌باشد که در ادامه توضیح داده می شود.

روش دیسک فیوژن ‌(Kirby Bauer)

در این روش از دیسک‌های کاغذی آغشته به آنتی‌بیوتیک استفاده می‌شود.این روش همچنین به روش Kirby-Bauer نیز مشهور است که به شرح زیر می‌باشد:

قبل از استفاده از محیط کشت آن‌ها را از یخچال خارج نموده و به مدت 20-10 دقیقه در انکوباتور 37 درجه قرار دهید تا رطوبت موجود در سطح آگار خشک گردد، سپس از استریل بودن محیط آزمایش اطمینان حاصل کرده و برای تلقیح نمونه، ابتدا با سواب استریل سوسپانسیون میکروبی را مخلوط کرده، سواب را باقدرت به دیواره لوله تکیه داده و فشار دهید تا آب اضافی آن گرفته شود، سپس آن را به محیط مولر هینتون انتقال داده و باکتری‌ها را به شکل کشت چمنی تلقیح کنید.

نکته: باید میزان کدورت سوسپانسیون باکتری با کدورت نیم مک فارلند مطابقت داشته باشد.

دیسک‌های آنتی بیوگرام را به‌وسیله پنس استریل و به فاصله 2/1 سانتی‌متر از یکدیگر در سطح پلیت قرار داده و با کمی فشار آن‌ها را کاملاً بر سطح آگار بچسبانید باید توجه داشت که ضخامت محیط کشت مولر هینتون آگار باید به طور یکنواخت در تماس با کف پلیت‌ها 5 میلیمتر باشد. سپس پلیت‌ها را به‌صورت وارونه در بن ماری با دمای 37 درجه به مدت 24 ساعت نگهداری کنید
پس از طی دوره انکوباسیون در بن ماری، هاله عدم رشد را به‌وسیله خط کش، در اطراف دیسک‌های آنتی‌بیوتیک اندازه‌گیری و باتوجه‌به جدول استاندارد CLSI،گزارش تست آنتی بیوگرام را برای هریک از آنتی‌بیوتیک‌ها به‌صورت حساس (Sensitive)،مقاوم (Resistsnt) و یا نیمه حساس (Intermediate) گزارش کنید.

روش تهیه محلول استاندارد 0.5 مک فارلند

محیط نیم مک فارلند محیطی در تست آنتی بیوگرام است که میزان کدر بودن نمونه خود را با آن مقایسه می‌کنیم. این محیط حاوی ۱۰۸ × ۱.۵ باکتری است. نحوه تهیه این محیط در آزمایشگاه به شرح زیر است: برای تهیه کدورت0.5 مک فارلند 0.5 میلی‌لیتر کلرید باریم 0.48 مولار را در 99.5 میلی‌لیتر اسیدسولفوریک0.36 نرمال مخلوط کنید. این محیط به مدت به مدت 6 ماه در تاریکی و در ظرف دربسته قابل نگهداری است. اگر در هر زمان رسوبی در لوله مشاهده شود محیط غیرقابل‌استفاده خواهد بود.

نکات مهم در انجام تست‌های آنتی بیوگرام در روش تست دیسک دیفیوژن:

باید توجه داشت که دیسک‌های مورداستفاده متناسب با نوع باکتری انتخاب شود، برای مثال، هیچگاه برای باکتری گرم منفی دیسکم پنی‌سیلین استفاده نکنید، زیرا نسبت به آن مقاوم است و یا برای کشت ادرار از دیسک کلرامفنیکل استفاده نکنید (زیرا این آنتی‌بیوتیک نمی‌تواند وارد مجاری ادرار شود).
هنگام خواندن نتیجه دقت کنید که همواره خط کش از وسط دیسک عبور کند.
همیشه قطر هاله عدم رشد را اندازه‌گیری کنید.
پس از تلقیح باکتری به محیط آنتی بیوگرام، در فاصله حداکثر 15 دقیقه باید دیسک‌ها در سطح آگار قرار داده شوند.
جهت تلقیح حتماً از نمونه استریل استفاده شود. اگر نمونه مورداستفاده استریل نباشد، تست کاملاً اشتباه خواهد بود.
در برخی از باکتری‌های سخت رشد برای انجام تست آنتی بیوگرام، از محیط کشت اختصاصی استفاده می‌شود.
تا زمانی که دیسک را روی محیط فشار نداده‌اید، می‌توانید جای آن را تغییر دهید، اما بعد از فشار دادن دیسک و تثبیت آن به‌هیچ‌عنوان دیسک را جا بجا نکنید.
قبل از کاشت دیسک‌ها بررسی کنید که حاوی مشخصات باشد.
اگر نمونه تلقیح شده پس از انکوباسیون به‌صورت یک‌دست رشد نکرده باشد، نشان‌دهنده این است که مقدار کلنی برداشت شده کمتر از استاندارد مک فارلند بوده است.
اگر در اطراف تمام دیسک‌ها هاله تشکیل شود و یا در اطراف هیچ یک از دیسک‌ها هاله‌ای تشکیل نشود باید تست تکرار شود.
اگر PH محیط مولر هینتون آگار مناسب نباشد نتایج اشتباه به دست می‌آید.
نگهداری غلط دیسک‌ها و استفاده از محیط‌های کشت تاریخ‌گذشته موجب خطا می‌شود.
دیسک‌ها باید حداکثر به مدت یک ماه در یخچال نگهداری شوند.

ذخیره‌سازی و نگهداری دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی:

باید دقت داشته باشیم دمای نگهداری هر دیسک بر روی جعبه آن درج می‌گردد که باید به آن توجه شود اما به‌طورکلی دیسک‌ها باید در یخچال و در دمای 8 درجه سانتی‌گراد و پایین‌تر، یا در فریزر با دمای 14- درجه سانتی‌گراد و پایین‌تر تا زمان مصرف نگهداری شوند.

تمامی دیسک‌های گروه بتالاکتام مانند پنی‌سیلین، آمپی‌سیلین، کربنی سیلین، تیکار سیلین، اگزاسیلین و نسل اول، دوم و سوم سالوس پورین‌ها باید در فریزر نگهداری شوند و فقط می‌توان مقداری از آن را بر اساس کار روزانه آزمایشگاه حداکثر به مدت یک هفته در یخچال نگهداری نمود.

بعضی آنتی‌بیوتیک‌های حساس مثل ایمیپنم، سفاکلر و ترکیبات کلاولانیک اسید یا سولباکتام اگر تا هنگام مصرف در فریزر نگهداری شوند، پایداری بیشتری خواهند داشت.

دیسک‌ها باید در ظروف دارای درپوش محکم و حاوی مواد جاذب رطوبت نگهداری شوند. دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی باید یک تا دو ساعت قبل از استفاده از یخچال یا فریزر خارج شوند تا به درجه حرارت اتاق برسند.

توضیح اصطلاحات هاله عدم رشد

اصطلاح »حساس« به گروهي از باکتری‌ها گفته می‌شود که باتوجه‌به غلظت آنتی‌بیوتیک و بر اساس دوز توصيه شده كه معمولاً در محل عفونت به دست می‌آید، مهار می‌شوند (هاله عدم رشد بزرگی ایجاد می‌کنند).
اصطلاح حساسیت بينابيني به گروهي از باکتری‌ها گفته می‌شود كه باتوجه‌به دوز متوقف‌کننده رشد (MIC) پاسخي پایین تر از با کتری‌های حساس می‌دهند. اصطلاح حساسيت بينابيني در موارد ذيل كاربرد دارد:
الف ) در مناطقي از بدن كه دارو از لحاظ فيزيولوژيك در بافت‌ها تغليظ می‌شودمانند (كينولونها يا بتالاکتام‌ها در ادرار).
ب) زماني كه مقدار دارو را می‌توان بيش از دوز معمولي آن استفاده كرد( مانند بتالاکتام‌ها).
ج) جهت ايجاد محدودهايی به‌منظور پيشگيري از خطاهاي كوچك و غیرقابل‌کنترل تكنيكي كه موجب تناقض و اختلالات اساسي تفسیر خواهد شد. اين امر به‌ویژه براي داروهايي صادق است كه حاشيه مسموميت دارويي آنها محدود است.

اصطلاح مقاوم به گروهي از باکتری‌ها گفته می‌شود كه:
1) رشد آنها با غلظت‌های معمولي دارو با دوز متداول تجويزشده مهار نشود.
2) هاله عدم رشد به‌دست‌آمده از آنها به علت مکانیسم‌هایی ويژه مقاومت ميكروبي نظير بتالاكتامازهايي مانند (MRSAها ياESBLها)بايد به‌صورت مقاوم گزارش گردد. همچنين در مطالعات درماني، اثربخشي باليني عامل ضدميكروبي براي اين باكتري نشان داده نشده است.

پلیت حاوی هاله عدم رشد

تفسیر نتایج در روش دیسک دیفیوژن:

پیش از خواندن نتیجه باید پلیت را از نظر رشد مناسب، همگون و خالص بودن گونه باکتری بررسی کرد (کلنی‌ها باید یک‌شکل باشند.) اگر هاله عدم رشد نامشخص و درهم باشد تکرار آزمایش لازم است. در صورت خالص بودن کشت و نیز مشخص‌بودن هاله عدم رشد باید مراحل اندازه‌گیری آن انجام گیرد. در مرحله اندازه‌گیری بدون باز کردن در پلیت و تنها از پشت پلیت و با استفاده از خط کش یا کولیس قطر هاله عدم رشد اندازه‌گیری و بر اساس میلی‌متر ثبت شود. به‌منظور تفسیر این نتایج از جداول استانداردی که توسط CLSI ارائه شده است، استفاده می‌گردد. با استفاده از این جداول و اندازه قطر هاله عدم رشد هر داروی ضدمیکروبی، باکتری در یکی از دسته‌های مقاوم، نیمه حساس و حساس قرار می‌گیرد.

جدول استاندارد CLSI

2. شرح آزمایش تست آنتی بیوگرام به روش رقیق کردن در محیط کشت مایع (Broth dilution)

آزمایش رقیق‌سازی برای تعیین کمی غلظت (به میلی‌گرم در میلی‌لیتر) عامل ضد میکروبی، جهت مهار یا کشتن باکتری استفاده می‌شود.

حداقل غلظت بازدارنده (MIC) را می‌توان با کشت میکروارگانیسم‌ها در محیط‌های مایع یا روی صفحات محیط رشد جامد تعیین کرد. مقدار MIC کمتر نشان می‌دهد که داروی کمتری برای مهار رشد ارگانیسم موردنیاز است؛ بنابراین، داروهایی با امتیاز MIC پایین‌تر، عوامل ضد میکروبی مؤثرتری هستند.

هدف از رقیق‌سازی به روش Broth dilution چیست؟

هدف از روش‌های رقیق‌سازی براث و آگار تعیین کمترین غلظت عامل ضد میکروبی سنجش شده (حداقل غلظت بازدارنده MIC) در آزمایشگاه می‌باشد که رشد باکتری را مهار می‌کند. رقیق‌سازی فرایندی است که در آن غلظت (مولاریته) محلول کاهش می‌یابد اما مقدار املاح (اتم، مول، گرم و غیره) ثابت می‌ماند. در این روش با افزودن حلال بیشتر، حجم آن را افزایش می‌دهند.

روش انجام تست Broth dilution

در این آزمایش لازم است 2 رقت از یک ماده ضدمیکروبی، در یک محیط کشت مایع که به درون لوله‌های حاوی حداقل حجم 2 میلی‌لیتر هستند، توزیع شود. این روش به نام Macrodilution)) شناخته می‌شود. در این روش از لوله‌های با حجم کمتر مانند پلیت میکرو تیتراسیون دارای 96 خانه استفاده می‌شود. سپس هر لوله را با حجم مناسبی از تلقیح میکروبی آماده شده در همان محیط بعد از رقیق کردن سوسپانسیون میکروبی استاندارد شده تلقیح می‌نمایند تا کدورت معادل 0.5 مک فارلند به دست آید. پس از این که به‌خوبی مخلوط شدند لوله‌های تلقیح شده یا پلیت 96 خانه‌ای را انکوبه کرده (اغلب بدون تکان دادن) و تحت شرایط مناسب بسته به میکروارگانیسم مورد آزمایش که انکوبه شده، استقرار می‌دهند.

3. شرح آزمایش تست آنتی بیوگرام به روش Etest:

این روش در واقع نوعی آنتی بیوگرام به روش دیسک دیفیوژن است که توانایی تعیین MIC را دارد.در این روش، غلظتهای مختلفی از آنتی‌بیوتیک در روی نوارهای پلاستیکی بسیار ظریف قرار داده شده است. این نوارها در روی سطح محیط کشت مولرهینتون آگار تلقیح شده با باکتری مورد آزمایش (غلظتی برابر کدورت 0.5 مک فارلند) قرار داده میشوند و بعد از ۱۸ ساعت انکوباسیون، نتیجه تست از جهت بالای نوار به‌طرف پایین نوار (از غلظت زیاد آنتی‌بیوتیک به سمت غلظت کم) خوانده میشود. نفوذ آنتیبیوتیک از نوار به محیط آگاردار اطراف آن باعث ایجاد یک هاله عدم رشد تخم‌مرغی یا بیضی‌شکل در اطراف هر نوار میشود. مقدار MIC آنتی‌بیوتیک جایی است که هاله بیضی‌شکل نوار پلاستیکی را قطع میکند.
ـست آنتی بیوگرام به روش Etest

روش انجام تست آنتی بیوگرام به روش Etest

ابتدا از کلنی‌های موجود در محیط بلاد آگار یا مک‌کارتی آگار، کشت (h24- 18)، ۴-۳ کلنی برداشته، و به لوله حاوی سرم فیزیولوژی استریل انتقال داده و لوله‌ها به مدت ۴۰ -۳۰ دقیقه در انکوباتور ۴۲ درجه سانتی‌گراد قرار داده می‌شوند تا سوسپانسیونی معادل کدورت 0.5 مک فارلند تهیه گردد. سواب استریل به لوله آغشته کرده و به جداره‌های داخلی لوله کاملاً تماس داده تا اضافی سوسپانسیون گرفته شود و سپس بر روی محیط مولرهینتون آگار در تمام جهات کشت داده تا در سطح پلیت کاملاً تلقیح گردد. پلیت‌ها را به مدت ۱۰-۵ دقیقه در دمای اتاق گذاشته تا رطوبت آنها جذب شود، سپس نوارهای E-test را با کمک پنس استریل در کنار شعله و زیر هود میکروبیولوژی روی سطح پلیت گذاشته و سپس در انکوباتور ۳۵ درجه سانتیگراد به مدت ۱۸ ساعت قرار می‌دهیم. در نهایت نتیجه تست باتوجه‌به دستورالعمل شرکت تولیدکننده و معیارهای CLSI قرائت می‌گردد.