کلون سازی مولکولی مجموعه ای از روش های آزمایشگاهی در زیست شناسی مولکولی است که برای سرهم بندی مولکول های DNA نوترکیب و تکثیر آنها در موجودات میزبان استفاده می شود. استفاده از کلونینگ کلمه اشاره به این واقعیت است که این روش شامل تکثیر یک مولکول برای تولید یک جمعیت از سلول های با مولکول های یکسان DNA است.

در یک آزمایش کلون سازی مولکولی متداول، DNA که باید کلون شود، از یک ارگانیسم مورد نظر تهیه و سپس با آنزیم ها در لوله آزمایش به قطعات کوچکتر DNA تبدیل می شود. سپس، این قطعات برای تولید مولکول های DNA نوترکیب با وکتور ترکیب می شود و سپس به یک ارگانیسم میزبان منتقل می شود و یک جمعیت از ارگانیسم هایی را تولید می کند که در آن ها مولکول های DNA نوترکیب در کنار DNA میزبان همانندسازی می شوند. این میکروارگانیسم ها، از آنجا که حاوی قطعات خارجی DNA هستند، اصلاح شده ژنتیکی (GMO) نامیده نی شوند. این فرایند از این واقعیت بهره می گیرد که یک سلول باکتریایی تنها می تواند یک مولکول DNA نوترکیب را به دست آورد و تکثیر کند. سپس این سلول می تواند گسترش یابد تا مقدار زیادی از سلول ها تولید شود که هر کدام شامل کپی های مولکولی نوترکیب اصلی می باشند. بنابراین، این جمعیت حاصل از سلول ها و مولکول DNA نوترکیب معمولا به عنوان “کلون” شناخته می شوند. به طور جدی، DNA نوترکیب به مولکول های DNA اشاره دارد، در حالی که کلونینگ مولکولی به روش های تجربی که برای جمع آوری آنها اشاره دارد اشاره دارد.

تقریبا هر توالی DNA می تواند کلون شود و تقویت شود، اما عوامل متعددی وجود دارد که می تواند موفقیت پروسه را محدود کند. نمونه هایی از توالی های DNA که کلون سازی دشوار دارند: تکرار معکوس، ریشه های تکرار، centromeres و تلومر است. یکی دیگر از ویژگی هایی که احتمال موفقیت را محدود می کند، اندازه بزرگ توالی DNA است. برای توالی های بزرگتر از ۱۰ Kb موفقیت بسیار محدود است، اما باکتریوفاژها مانند باکتریوفاژ λ و حامل های دیگر می توانند استفاده شوند.