در بیولوژی مولکولی، واکنش زنجیره ای پلی مراز یا PCR، بمنظور تکثیر یک قطعه DNA مورد استفاده قرار میگیرد. اصول کار PCR در سال ۱۹۸۴ توسط کری مولیس (Kary Mullis) ارائه شده است. در این تکنیک، یک مولکول DNA میلیونها بار تکثیر میشود. در پروتکل PCR سیکل های دمایی (Cycle) ایجاد میشود. در ابتدا با ایجاد حرارت و رساندن دمای محلول به نقطه ذوب DNA، دو رشته DNA از هم جدا میشوند. در مرحله بعد با کاهش دما یک آنزیم DNA پلیمراز فعال شده، عمل همانند سازی (Replication) را انجام میدهد. DNA پلیمراز آنزیمی است که با استفاده از نوکلئوتیدها (مصالح ساختمانیDNA)، رشته الگو (DNAی مورد مطالعه) و یک قطعه پرایمر قادر به همانند سازی است. صحت نتایج nv اصول کار PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد. پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه َ۳ در مولکول DNAی مورد نظر هستند. بنابر این بطور اختصاصی فقط به این مولکولها متصل شوند. چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل میشود، در نتیجه فقط مولکول DNAی هدف همانند سازی و تکثیر میگردد.
با اعمال تغییرات دمایی بطور متوالی و برنامه ریزی شده، روند PCR تکرار گردیده و در هر مرحله DNA دو برابر میشود. بنابر این تعداد مولکولهای DNA بصورت تصاعدی و به نسبت n2 افزایش می یابد که n تعداد سیکل های دمایی است. مثلا یک مولکول DNA، پس از ۲۰ سیکل به ۱٫۰۴۷٫۵۸۶ مولکول تکثیر میشود. در مرحله همانند سازی، برای جدا نگهداشتن دو رشته DNA، باید دمای محلول بالا باشد. بنابر این از یک نوع آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت استفاده میشود. اولین آنزیمی که بدین منظور مورد استفاده قرار گرفت Taq polymerase بود که از باکتری ترموس آکواتیکوس (Thermusaquaticus) بدست می آید. امروزه PCR بعنوان یک ابزار مهم در فعالیتهای تحقیقاتی و بالینی محسوب میشود.
بعضی از کاربردهای PCR عبارتند از: کلونینگ DNA بمنظور تعیین توالی، فیلوژنی بر اساس DNA (آنالیزعملکردی ژنها)، تشخیص بیماریهای ارثی، انگشت نگاری ژنتیکی (در تعیین والدین و جرم شناسی) و تشخیص بیماریهای عفونی. در سال ۱۹۹۳ به پاس ابداع تکنیک PCR، جایزه نوبل به کری مولیس اهداء گردید. PCR برای تکثیر بخشهای خاصی از مولکول DNA مورد استفاده قرار میگیرد. این بخشها ممکن است یک ژن کامل، قسمتی از یک ژن یا سکانسهای بین ژنها باشند. در بسیاری از روشهای PCR، قطعات DNAی هدف حداکثر ۱۰ کیلو جفت باز (kb) دارند. اگرچه در بعضی از روشهای خاص، قطعات بزرگتر حتی تا kb40 را هم میتوان تکثیر کرد.
محلول PCR معمولا حاوی مواد زیر است:
۱٫ DNAی الگو: شامل DNAی هدف است که تکثیر میگردد.
۲٫ پرایمرهای Forward و Reverse: به گونه ای طراحی شده اند که هر یک مکمل ناحیه َ۳ در یکی از رشته های DNA باشد.
۳٫ Taq polymerase یا DNA پلیمراز دیگری که دمای بهینه اش در حدود ۷۰ درجه سانتیگراد باشد.
۴٫ دزوکسی نوکلئوزید تری فسفاتها (dNTPs): مصالح ساختمانی که توسط DNA پلیمراز برای ساختن رشته های DNAی جدید بکار میروند.
۵٫ محلول بافر: شرایط محیطی مناسبی را از نظر pH و یونهای مختلف ایجاد میکند تا پایداری DNA پلیمراز و فعالیت بهینه آن تامین شود.
۶٫ کاتیونهای دو ظرفیتی: یونهای منیزیم یا منگنز
۷٫ کاتیون یک ظرفیتی: یون پتاسیم n محلولPCR معمولا به حجم ۱۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر در لوله های کوچک ۰٫۲ تا ۰٫۵ میلی لیتر تهیه میشود.
- این لوله هل در بلوکهای مخصوصی در دستگاه ترموسایکلر قرار داده میشوند. ترمو سایکلر، طبق برنامه ریزی انجام شده، دمای لوله ها را در زمانهای مشخصی افزایش و کاهش میدهد تا مراحل مختلف PCR انجام شود. برای جلوگیری از تبخیر محلول (و در نتیجه افزایش غلظت در بخشهای بالائی محلول)، معمولا یک لایه روغن بر سطح محلول قرار داده مبشود. ولی در دستگاه های جدیدتر از درپوش های حرارتی استفاده میشود. n در روش PCR تغییرات دمائی(سیکل ها) بین ۲۰ تا ۴۰ بار تکرار میشود.
- تعداد سیکل ها با توجه به مقدار DNAی اولیه، شرایط آزمایش و مقدار محصول مورد نیاز انتخاب میشود. دمای لوله ها و فواصل زمانی هم تابع عوامل مختلفی است از جمله: نقطه ذوب پرایمرها (Tm)، نوع DNA پلیمراز، غلظت یونهای دو ظرفیتی و غلظت dNTPها.
مراحل اجرایی در اصول کار PCR
- مرحله شروع (Initialization step): به مدت ۱ تا ۹ دقیقه دمای محلول به ۹۴ تا ۹۶ درجه (یا ۹۸ درجه اگر پلیمرازها کاملا به حرارت مقاوم باشند) رسانیده میشود. این مرحله فقط برای DNA پلیمرازهایی ضروری است که نیازمند فعال شدن توسط حرارت در روشhot-start PCR هستند.
- مرحله واسرشت (Denaturation step): این مرحله اولین قسمت از سیکل های حرارتی منظم است و شامل حرارت دادن محلول به مدت ۲۰ تا ۳۰ ثانیه در دمای ۹۴ تا ۹۸ درجه است. در این مرحله بعلت گسستن پیوندهای هیدروژنی (بین نوکلئوتیدها)، DNAی الگو و پرایمرها از هم جدا میشوند و تک رشته های DNA حاصل میگردد.
- مرحله اتصال (Annealing step): دمای محلول به مدت ۲۰ تا ۴۰ ثانیه به ۵۰ تا ۶۵ درجه کاهش می یابد. در این مرحله پرایمرها به تک رشتهای DNAی الگو متصل میشوند. بطور طبیعی، دمای اتصال (Annealing temperature) در حدود ۳ الی ۵ درجه پائین تر از نقطه ذوب پرایمرها است. پیوندهای هیدروژنی پایدار فقط زمانی شکل میگیرد که سکانس پرایمر و رشته الگو مکمل یکدیگر باشند. آنزیم پلیمراز پس از اتصال به هیبرید پرایمر-الگو، همانند سازی DNA را آغاز میکند
- مرحله طویل شدن (Extension/elongation step): دمای محلول در این مرحله باید متناسب با نوع DNA پلیمراز مورد استفاده باشد. دمای اپتیمم برای آنزیم Taq polymerase حدود ۷۵ الی ۸۰ درجه است که معمولا دمای ۷۲ درجه انتخاب میشود. در این مرحله آنزیمDNA پلیمراز با استفاده از dNTP های موجود در محلول، یک رشته DNAی جدید را در جهت َ۵ به َ۳ و در مقابل رشته های الگو میسازد.مدت زمان این مرحله نیز باید متناسب با نوع DNA پلیمراز و طول رشته DNA باشد. در دمای بهینه، DNA پلیمراز در هر دقیقه، یک هزار باز را پلیمریزه مینماید. در مرحله طویل شدن در صورت وجود سوبسترای کافی و تامین شرایط بهینه، مقدار DNA در محلول PCR دو برابر میشود. بنابر این در هر سیکل PCR، غلظت DNA بصورت تصاعدی افزایش می یابد.
- مرحله طویل شدن نهایی (Final elongation): این مرحله، پس از آخرین سیکل PCR، به مدت ۵ الی ۱۵ دقیقه در دمای ۷۰ الی ۷۴ درجه انجام میشود، تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند.
- نگهداری نهایی (Final hold): در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵ درجه قابل نگهداری است.
- الکتروفورز در ژل آگارز: نهایتا میتوان محصولات PCR را بر روی ژل آگارز و همراه با مارکر وزن مولکولی(DNA lader که حاوی قطعات DNA با اندازه های مشجص است) الکتروفورز نمود، تا صحت انجام PCR بررسی شود.
کاربردهای PCR
- تشخیص بیماریها: از پروتکل PCR برای بررسی بسیاری از بیماریها استفاده میشود. مثلا در تشخیص بدخیمی هایی نظیر لوسمی (leukemia) و لنفوم (lymphomas)، سنجش PCR مستقیما بر روی DNAی ژنومی انجام میشود تا تغییر در بیان ژنها بررسی گردد. حساسیت این روش ده هزار برابر روشهای معمول است. PCR را میتوان بمنظور شناسائی میکروارگانیسمهایی بکار برد که قابل کشت نیستند و یا سرعت رشد آنها در محیط کشت خیلی کند است از جمله میکوباکتریها (mycobacteria)، باکتریهای غیر هوازی (anaerobic bacteria) و ویروسها (viruses). در مطالعات میکروبیولوژی از روش PCR برای شناسائی عوامل عفونت زا و تشخیص گونه های پاتوژن از غیر پاتوژن نیز استفاده میشود. بدین منظور ژنهای خاصی رهگیری و تعیین مقدار میشوند. بدلیل حساسیت بالای PCR، میتوان بلافاصله پس از عفونت و قبل از ظهور بیماری، وجود میکروارگانیسمها را بررسی و اقدامات درمانی را آغاز کرد.
- تحقیقات جنایی (forensic analysis): در صحنه جرم، معمولا مقدار DNA بسیار کم است. بنابر این با روش PCR میتوان تکثیر DNA را انجام داد تا مقادیر کافی از مولکولهای ژنتیکی بدست آید. سپس ماهیت DNA بررسی میشود.
- انگشت نگاری ژنتیک (genetic fingerprinting): با پروتکل PCR میتوان با توجه به ماهیت DNA به هویت اشخاص پی برد. بعنوان مثال والدین را شناسائی کرد و یا رابطه ژنتیکی افراد را بررسی نمود. همچنین رابطه تکاملی موجودات زنده نیز با روش انگشت نگاری ژنتیکی قابل مطالعه است.
- بررسی DNA قدیمی (ancient DNA): با روش PCR، مولکولهای DNA بسیار قدیمی حتی متعلق به ده ها هزار سال قبل مورد مطالعه قرار گرفته است. مثلا DNA یک ماموت از چهل هزار سال قبل، مومیایی های مصری و تزار روسیه با این تکنیک بررسی شده است.
- جداسازی DNAی ژنومی: با پروتکل PCR میتوان بخشهایی از DNAی ژنومی را انتخاب و پس از جداسازی تکثیر نمود. مثلا برای کلونینگ DNA و یا تولید شاخصهای دورگه سازی (hybridization probes) در روشهای Southern و Northern، مقادیر زیادی از DNA مورد نیاز است که با روش PCR قابل تهیه است. همجنین در مواردی که حجم نمونه اولیه بسیار کم باشد، با روش PCR میتوان DNAی موجود را تکثیر کرد و سپس مورد مطالعه قرار داد.
- تعیین توالی DNA (DNA sequencing): پس از تکثیر DNA با روش PCR، میتوان توالی نوکلئوتیدی را تععیین کرد و در صورت لزوم به پلاسمید باکتری یا DNAی کروموزومی در یوکاریوتها الحاق نمود و بدین ترتیب DNAی نوترکیب (recombinant DNA) ایجاد کرد. حتی در مرحله بعد میتوان سریعا با استفاده از PCR، کلنی های باکتری را از نظر وجود این DNAی نوترکیب مورد بررسی قرار داد.
- تشخیص قبل از تولد بیماریهای ژنتیکی : در این روش تعدادی از سلولهای جنین را استخراج کرده و با پرایمر اختصاصی برای یک ژن بیماری مجاور می کنند ، همچنین بطور جداگانه با پرایمر ژن سالم نیز مجاور می کنند و PCR انجام می دهند . پس از پایان PCR تفسیر آزمایش چنین خواهد بود : اگر در هردو لوله سنتز DNA انجام شود ، جنین یک ژن سالم و یک ژن بیمار دارد یعنی حامل است ولی بیمار نیست . اگر سنتز DNA فقط در لوله ای که شناساگر مخصوص ژن بیمار وجود دارد انجام شود جنین بیمار است و باید سقط شود . اگر سنتز DNA فقط در لوله ای که حاوی شناساگر ژن سالم است انجام شود ، جنین کاملاَ سالم است . امروزه بسیاری از بیماریهای ژنتیکی مانند هموفیلی ، کم خونی داسی شکل ، سیستیک فیبروزیز (Cystic Fibrosis ) ، تالاسمی ، سندرم لش – نیهان ، دیستروفی عضلانی دوشن ، فاویسم ، فنیل کتون اوری و غیره را می توان به کمک PCR تشخیص داد.
مشکلات PCR:
با تمامی مزیت های فوق PCR مشکلات خاص خود را دارد . مهمترین مشکل در اصول کار PCR آلودگی نمونه های مورد بررسی است . به دلیل حساسیت فوق العاده و قدرت تکثیر زیاد PCR هر قطعه DNA خارجی که وارد محیط PCR شود ، مورد تکثیر قرار گرفته و نتایج عجیب و دور از واقعیتی به وجود خواهد آورد . برای مثال در مورد تحقیقی که در تعیین جنسیت با استفاده از خون مادران باردار بیان شد ، در بین جوابها یک مورد مثبت کاذب برای یکی از زنان غیر باردار که به عنوان شاهد منفی استفاده شده بود ، وجود داشت . پس از بررسی معلوم شد که تعداد ناچیزی از سلولهای پوست یکی از کارکنان مرد آزمایشگاه وارد لوله ی PCR شده است . گاهی نیز باقیمانده ی قطعات DNA حاصل از تکثیر DNA های قبلی باعث آلودگی PCR می شود که در این مورد شستشوی زیاد و دقیق مشکل گشا است .
لینک های مفید
Share It