بررسی تکثیر و بقای سلولی از تکنیکهای مهم و اساسی در آزمایشگاههای سلولی محسوب میشود. این بررسی نیازمند کمّی سازی دقیق تعداد سلولهای زنده در محیط کشت سلولی است. بنابراین روشهای محاسبۀ بقای سلولی جهت بهینه سازی شرایط کشت سلول، ارزیابی عوامل رشد سلولی، کشف آنتی بیوتیکها و داروهای ضد سرطان، ارزیابی اثرات سمّی آلاینده های محیطی و مطالعات آپوپتوز ضروری هستند. برای چنین اهدافی روشهای متعددی میتوانند مورد استفاده قرار گیرند اما روشهای غیرمستقیم با استفاده از نشانگرهای فلورسنت یا رنگزا (کروموژن)، روشهایی بسیار سریع در مقیاس بزرگ را فراهم می کنند. از میان این روشها، سنجش بقای سلولی با تست MTT پرکاربردترین روش محسوب می شود. پروتکل MTT ، یک روش رنگ سنجی برای بررسی تکثیر و بقای سلولها است که در سال ۱۹۸۳ توسط Mossman معرفی گردید.
اساس پروتکل MTT مبتنی بر فعالیت میتوکندری می باشد.
فعالیت میتوکندریایی در سلولهای زنده به صورت پایدار است و بنابراین افزایش یا کاهش تعداد سلولهای زنده به صورت خطی با فعالیت میتوکندری در ارتباط می باشد. رنگ تترازولیموم MTT در سلولهای فعال (به لحاظ متابولیکی)، إحیا می شود. آنزیمهای دهیدروژناز میتوکندریایی در سلولهای زنده، حلقۀ تترازولیوم را شکسته و با تولید NADH و NADPH منجربه تشکیل رسوب نامحلول ارغوانی رنگ به نام فورمازان میشوند. این رسوب میتواند توسط ایزوپروپانول یا دی متیل سولفواکسید حل شود. از سوی دیگر، سلولهای مرده، چنین توانایی را نداشته و بنابراین سیگنالی را نشان نمی دهند. در این روش، تشکیل رنگ به عنوان نشانگر سلولهای زنده مورد استفاده قرار می گیرد. شدت رنگ تولید شده، در طول موج ۵۴۰ تا ۶۳۰ نانومتر اندازه گیری می شود و به طور مستقیم با تعداد سلولهای زنده متناسب است.
کاربردهای مهم تست MTT عبارتند از :
- اندازه گیری تکثیر سلولی در پاسخ به عوامل رشد، سایتوکاینها، میتوژنها و مواد مغذی
- تجزیه و تحلیل ترکیبات کشندۀ سلول یا متوقف کنندۀ رشد سلول مانند داروهای ضد سرطان، سموم، آلایندههای محیط زیست و سایر عوامل دارویی
- ارزیابی واسطه های فیزیولوژیک و آنتیبادیهای مهار کنندۀ رشد سلولی
- کشف دارو، غربالگری داروهای سمی و ضد سرطان
- مطالعۀ فعالیت سلول
- بررسی اتصالات سلولی
- مطالعات سمیّت شیمیایی
ایمنی بالا و فراهم نمودن یک سیستم رنگ سنجی و غیر رادیواکتیو از مزایای مهم این روش محسوب می شوند. استفاده از کیت های تجاری بسیار راحت است، حساسیت و دقت بالایی دارد. از سوی دیگر بازدهی بالایی برای اندازه گیری تکثیر، بقاء و مرگ و میر سلولی دارد و روش اجرای آن نیازی به مراحل وقت گیر شستشو و انتقال از یک پلیت به پلیت دیگر را ندارد. نمونه های مورد بررسی در این روش عبارتند از سلولهای چسبنده یا معلق و سلولهای تکثیر شونده یا غیر تکثیر شونده.
پروتکل MTT
- سلول های مورد نظر را تا آنجا کشت داده که به تراکم یا تعداد مورد نظر برسند.
- سلولهای را از فلاسک جدا کرده و می شماریم.
- میزان مورد نیاز از سلول ها را در خانه های پلیت ۹۶ می ریزیم (seeding).
- ۲۴ ساعت انکوباسیون.
- دارو ها را می توان با دوز ها و روش های مختلف به سلول های هر خانه اضافه کرد (treatment).
- بسته به نوع تست، ساعات انکوباسیون با دارو می تواند ۲۴، ۴۸ و یا ۷۲ ساعت باشد.
- پس از انکوباسیون دارو، مایع رویی در هر خانه را خارج می کنیم.
- ۶۰ میکرولیتر محلول MTT به هر خانه اضافه می کنیم.
- پس از گذشت ۳ تا ۴ ساعت، محلول را خارج می کنیم.
- توسط DMSO که یک حلال قوی است، رنگ بنفش را موجود در خانه ها را حل می کنیم.
- با استفاده از نانودراپ و در ۵۷۰ نانومتر، جذب را خوانده و IC50 را محاسبه می کنیم.
Share It