تکنیک کلونینگ TOPO

کلونینگ TOPO یک تکنیک زیستی است که در آن قطعات DNA بدون نیاز به DNA لیگاز در وکتورهای خاص کلون می شوند. برای کلونینگ TOPO-TA “پایان چسبنده” ، پلیمراز Taq دارای یک فعالیت ترانسفراز ترمینال غیر وابسته به الگو است که یک دئوکسی آدنوزین منفرد (A) را به انتهای 3’از محصولات PCR اضافه می کند. این ویژگی در کلونینگ TOPO مورد سوء استفاده قرار می گیرد. برای کلون کردن “پایان صاف” TOPO ، وکتور گیرنده فاقد شکاف است و قطعات DNA انتهایی می توانند کلون شوند.

کلونینگ TOPO

این روش از فعالیت بیولوژیکی ذاتی DNA توپوایزومراز I. استفاده می کند. نقش بیولوژیکی توپوایزومراز شکاف و پیوستن دوباره سوپرکویل DNA است که به همانند سازی کمک می کند. توپوایزومرازI ویروس واکسینیا به طور اختصاصی توالی DNA 5´- (C / T) CCTT-3 را تشخیص می دهد. در حین تکثیر ، آنزیم DNA را به طور اختصاصی در این دنباله هضم می کند، DNA را از بین می برد و دوباره در گروه 3 فسفات باز تیمیدین اتصال ایجاد می کند.

وکتورهای TOPO به گونه ای طراحی شده اند که این دنباله خاص 5´- (C / T) CCTT-3 را در دو انتهای خطی حمل می کنند. DNA وکتور خطی در حال حاضر آنزیم توپوایزومراز را به صورت کووالانسی به انتهای “3 آزاد” رشته متصل شده دارد. سپس با محصولات PCR مخلوط می شود. هنگامی که 5 انتهای آزاد رشته های PCR به انتهای توپوایزومراز / 3 ‘هر رشته وکتور وصل شود، رشته ها به صورت کووالانسی توسط توپوایزومراز مرتبط می شوند. این واکنش وقتی کار می کند که این محلول در دمای اتاق با نمک مورد نیاز انکوبه شود.

انواع مختلف وکتورها برای کلون کردن قطعات تکثیر شده توسط Taq یا Pfu پلیمراز استفاده می شوند زیرا Taq پلیمراز (بر خلاف Pfu) یک نوکلئوتید اضافی “A” در 3’end در طول اضافه می کند.

تکنیک کلونینگ TA TOPO به توانایی آدنین (A) و تیمین (T) در قطعات مختلف DNA برای هیبریداسیون متکی است و در صورت وجود لیگاز یا توپوایزومراز، به هم متصل می شوند. قطعه درج شونده با روش PCR و با استفاده از Taq DNA پلیمراز ساخته می شود، پلیمرازی که فاقد فعالیت تصحیح 3 و 5 می باشد و با احتمال زیاد ، یک باز 3-آدنین را به انتهای محصول PCR اضافه می کند. اگر پرایمرهای PCR دارای گوانین در انتهای 5 باشند بهتر است زیرا این امر احتمال افزودن آدنوزین توسط Taq پلیمراز را به حداکثر می رساند.

پلیمرازهای مقاوم در برابر حرارت که حاوی فعالیت اگزونوکلئاز 3-3 تا 5´ گسترده هستند، نباید مورد استفاده قرار گیرند، زیرا آنها 3-آدنین آزاد ایجاد نمی کنند. وکتور هدف خطی شده و با یک آنزیم محدود کننده با انتهای صاف برش داده می شود. این بردار سپس با استفاده از ترمینال ترانسفراز ترانس فسفات (ddTTP) و با دی دئوکسی تیمیدین دنباله دار می شود. استفاده از ddTTP برای اطمینان از افزودن تنها یک باقیمانده T بسیار مهم است.

از پلیمرازها (مانند Phusion) یا آنزیمهای محدود کننده که انتهای صاف ایجاد می کنند نیز می توانند برای کلونینگ TOPO استفاده شوند. به جای تکیه بر انتهای چسبنده، در انتهای صاف وکتور های TOPO مولکولهای توپوایزومراز قرار دارند. برای این منظور کیت های تجاری مانند کیت کلونینگ Zero Blunt® از Invitrogen در دسترس است.

لینک های مفید: