پروتوکل, علمی و آموزشی

روش آماده سازی ژل آگارز برای الکتروفورز

اماده سازی ژل آگارز

روش آماده سازی ژل آگارز برای الکتروفورز از بافر و پودر آگارز استفاده می شود. نسبت این دو بستگی مستقیمی به سایز و شکل DNA یا مولکول هایی که قرار است الکتروفورز شوند دارند. برای تهیه ژل آگارز ، معمولا پودر آگارز را در یک بافر مناسب حل می کنند؛ از جمله بافرهایی که برای این کار استفاده می شوند TAE و TBE را می توان نام برد. بافر TAE از تریس ، استیک اسید و EDTA تشکیل شده است و برای تنظیم اسیدیته محیط به کار می رودو غلظت آن در ژل و تانک الکتروفورز باید یکسان باشد تا حین برقراری جریان الکتریکی، تعادل یونی بین ژل و بافر تانک ایجاد شده و اختلالی در حرکت نمونه های DNA رخ ندهد. در بافر TBE به جای استیک اسید از اسید بوریک استفاده می شود. بافر TAE دارای کمترین ظرفیت بافری می باشد اما قدرت تفکیک آن برای مولکول های بزرگ DNA بسیار خوب می باشد. معمولا بافرهایی که حاوی EDTA هستند، جهت غیر فعالسازی انواع نوکلئازهایی که نیازمند کاتیون های دوظرفیتی جهت فعالیت خود می باشند، روش آماده سازی ژل آگارز برای الکتروفورز استفاده می کنند.

فاکتورهای زیادی می توانند مهاجرت اسیدهای نوکلئیک را تحت تاثیر قرار دهند:‌ اندازه های منافذ ژل (غلظت ژل)، اندازه قطعات DNA ، ولتاژ اعمال شده، قدرت یونی بافر، و غلظت رنگ intercalate شونده (مانند اتیدیوم برماید) درصورتی که در طی الکتروفورز افزوده شود. مولکول های کوچک تر سریعتر از مولکول های بزرگتر در ژل حرکت می کنند و DNA دو رشته ای با نرخ ۱/LOG تعداد بازها در ژل حرکت می کند. اما این رابطه برای توالی های با طول بسیار بلند صادق نمی باشد. افزایش غلظت ژل موجب کاهش سرعت حرکت DNA بر روی ژل می شود.

از طرف دیگر کنفورماسیون DNA می تواند حرکت آن را بر روی ژل تحت تاثیر قرار دهد. به عنوان مثال DNA سوپر کویل شده دارای حرکتی سریعتر از DNA ریلکس می­باشد، زیرا DNA سوپرکویل شده فشرده تر می باشد و از این رو راحت تر بر روی ژل حرکت می کند. ژل الکتروفورز مولکول های پلاسمیدی نشان دهنده حالت سوپر کویل منفی می باشد. اما مولکول DNA حلقوی باز (Nicked) و فرم های ریلکس حلقوی به صورت باندهای کوچکتر ظاهر می شوند.

اتییدیوم برماید که می تواند بین دو رشته DNA قرار بگیرد، می تواند بار، طول و نیز حالت سوپرکویل مولکول DNA را تحت تاثیر قرار دهد و بنابراین حضور آن در ژل در هنگام عمل الکتروفورز حرکت DNA را تحت تاثیر قرار می دهد. ژل الکتروفورز آگارز می­تواند جهت جداسازی انواع DNA حلقوی با توپولوژی سوپرکویلینگ مختلف نیز مورد استفاده قرار بگیرد.

مشکلات احنمالی در آماده سازی ژل آگارز برای الکتروفورز :

  • ژل خندان (smily gel): این حالت زمانی رخ می دهد که ولتاژ اعمال شده برای غلظت های ژل مورد استفاده خیلی زیاد باشد.
  • بیش از اندازه DNA ریختن: این امر موجب حرکت کند قطعات DNA خواهد شد.
  • کثیف شدن ژل:‌ وجود ناخالصی هایی مانند نمک ها و یا پروتئین ها می تواند حرکت DNA را تحت تاثیر قرار دهد.

 

روش آماده سازی ژل آگارز برای الکتروفورز

باید نسبت بافر و پودر آگارز به گونه ای باشد که درصد آگارز مورد نظر را ایجاد کند؛ بافر معمولا در غلظت های ۱x، ۵x ، ۱۰x و … تهیه می شود.  پور آگارز و بافر را در با نسبت های معین و محاسبه شده با هم مخلوط می کنیم. در این آزمایش برای تهیه ژل ۱ درصد و با داشتن بافر ۵x، ده میلی لیتر از بافر را با ۰٫۵ گرم آگارز مخلوط کرده و سپس ارلن مخلوط را روی حرارت قرار میدهیم .

– با به جوش آمدن مخلوط یا به محض شفاف شدن آن (حل شدن پودر آگارز) آن را از روی حرارت برداشته و ارلن را در محیط آزمایشگاه قرار می دهیم تا مواد کمی از دما بیفتند.

– وقتی دمای ژل به ۵۰ تا ۶۰ درجه رسید آن را به سینی مخصوص ژل منتقل می کنیم؛ باید دقت شود که این کار به آهستگی و به طور یکنواخت انجام شود تا حبابی در ژل ایجاد نشود. در صورت ایجاد حباب نیز باید آن را با سر سمپلر یا هر وسیله مناسب و تمیز دیگری از بین برد.

– بعد از بستن ژل ، آن را با سینی به ظرف تانک لکتروفورز منتقل نموده و برای انجام عمل الکتروفورز استفاده می کنیم.

 

غلظت های مختلف آگارز جهت جداسازی قطعات DNA با اندازه های متفاوت

درصد آگارز

قدرت جداسازی DNA

۳ ۱۰۰-۱۰۰۰ bp
۲ ۲۰۰-۱۵۰۰ bp
۱٫۵ ۳۰۰-۳۰۰۰ bp
۱ ۵۰۰-۵۰۰۰ bp
۰٫۸ ۱۰۰۰-۷۰۰۰ bp
۰٫۶ ۱۰-۳۰ kb
۰٫۴ ۳۰-۵۰ kb

 

لینک های مفید

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *