غربالگری کلنی توسط PCR

روش غربالگری کلنی توسط PCR سریعترین راه برای غربالگری کلنی های باکتریایی است. ( دستگاه PCR ما ۲۴ لوله را می گیرد، بنابراین غربالگری ۲۲ کلنی + ۱ منفی + ۱ کنترل مثبت انجام می شود.)

انتخاب پرایمرها

در حالت ایده آل یک جفت پرایمر که فقط اگر ساختار صحیح موجود باشد، کار می کند. یک پرایمر وکتور و یک پرایمر خاص ژن.

پروتکل غربالگری کلنی توسط PCR

تعداد ۲۴ نمونه لوله PCR را که حاوی ۵ میلی لیتر H2O است تهیه کنید.یک میکروتیوب تازه (یا نوک زرد) را به یک کلنی تماس دهید، آن را به داخل لوله PCR بکشید، سپس آن را بر روی یک پلیت آگار که شماره گذاری شده (یعنی تمام ۲۴ کلنی در یک پلیت آگار) تماس دهید. این کار را برای ۲۲ (یا هرکدام) کلنی تکرار کنید. برای لوله ۲۳ (کنترل منفی) از کلنی که قطعا منفی است استفاده کنید(یا از هیچ چیزی استفاده نکنید) .برای لوله ۲۴ (کنترل مثبت) از کلنی استفاده کنید که یک محصول را با پرایمرهای شما تولید می کند.اگر شما کلنی +  ندارید، از مقدار کمی DNA پلاسمید استفاده کنید.

 انکوبه کردن پلیت آگار در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد.این کلونی های در عرض ۶-۸ ساعت قابل مشاهده است، بنابراین شما می توانید در همان روز از miniprep های شبانه استفاده کنید.

Set up a 25 x PCR pre-mix as follows:

۱ x pre-mixComponent۲۵ x pre-mix
۱۱٫۵ µl
2 µl
0.6 µl
0.5 µl
0.1 µl
0.1 µl
5 µl
0.2 µl
H2O
10 x PCR buffer
MgCl2 (50 mM)
10mM dNTPs (i.e. a mixture of all four at 10 mM each)
primer 1 (100 µM)
primer 2 (100 µM)
Template
cheap Taq
۲۸۷٫۵ µl
50 µl
15 µl
12.5 µl
2.5 µl
2.5 µl
0 µl
5 µl

۱۵ میکرولیتر از این میکس به هر لوله PCR اضافه کنید.

  • برنامه PCR
CyclesTemperatureDuration
   
۱۹۴°C۶۰ seconds
   
۲۵۹۴°C۳۰ seconds
۵۵°C۳۰ seconds
۷۲°C۱ minute

این PCR باید کمتر از ۲ ساعت طول بکشد. در حالیکه PCR در حال اجرا است، ژل آگارز را برای تجزیه و تحلیل محصولات PCR آماده کنید.بعد از بررسی نتیجه می توانید در همان روز به پلیت آگار بروید و محیط های miniprep را از کلنی های احتمالی تنظیم کنید.

لینک های مفید: