کشت سویه‌های میکروبی
در این مقاله کوشیده‌ایم ضمن گردآوری مطالب کاربردی جهت انتخاب محیط کشت مناسب آزمایش میکروبی شما، به برسی انواع محیط کشت میکروبی و ارائه خلاصه‌ای از ویژگی‌های مواد مورداستفاده در این محیط کشت‌ها داشته باشیم.
همان‌طور که میدانیم نتایج آزمایشگاهی به جمع‌آوری نمونه‌های باکیفیت میکروبی بستگی دارد ازاین‌رو اولین قدم جهت کشت سویه‌های میکروبی آموزش صحیح نمونه‌برداری، نگهداری و انتقال ایمن آنهاست.
نمونه‌برداری میکروبی
نمونه‌گیری میکروبی، مجموع روشی است که به محققین اجازه می‌دهد تا به کمک آن اطلاعاتی را درباره یک‌گونه میکروبی بر اساس نتایج کشت میکروبی در آزمایشگاه استنباط کنند، بدون اینکه نیازی به بررسی هر سویه به طور انفرادی باشد (مشت نمونه خروار). ازآنجایی‌که نمونه‌گیری صحیح در یک مطالعه، هزینه و حجم کار را کاهش می‌دهد و به به‌دست‌آوردن اطلاعات باکیفیت بالا کمک می‌کند، لازم است که اقسام نمونه‌برداری و کاربردهای هر یک را بلد باشیم.
به‌طورکلی نوع نمونه گرفته شده به هدف تحقیق بستگی دارد. اهمیت نتایج دقیق را نمی‌توان نادیده گرفت زیرا نتایج آزمایش زندگی مردم را چه به طور مستقیم مانند آزمایش پاتوبیولوژی و چه غیرمستقیم مانند تحقیق و توسعه باکتری‌های نوترکیب صنعتی تغییر می‌دهد.
- توصیه میشود از سواب خشک برای سطوح مرطوب و سواب مرطوب برای سطوح خشک استفاده کنید.
- دستکش مناسب بپوشید.
- سواب را از لوله خارج کنید (در صورت استفاده از سواب با ماده مرطوب‌کننده، قبل از نمونه‌برداری بیشتر آن را در طرفین لوله فشار داده تا کمی تخلیه گردد)
- با چرخاندن آرام سواب به جلو و عقب سطح را سواب بکشید. برای تعیین کمیت مقدار کپک یا باکتری روی سطح آزمایش، یک سطح شناخته شده (مثلاً 100 سانتی‌متر مربع) را سواب بزنید.
- پس از نمونه‌برداری، سواب را در لوله قرار دهید و درپوش را محکم ببندید و نمونه را به طور مناسب برچسب بزنید.
محیط کشت های میکروبی جدای از کاربردخاص مثلا انتخابی، اختصاصی و یا رشد و نگه داری به 3 دسته کلی تقسیم میشوند که بنا به نوع گونه میکروبی از آنها استفاده میشود.
- مایع
- جامد
- نیمه جامد (ژله ایی مانند)
نکته قابل توجه :
به محیط کشت های مایع، براث و به محیط کشت های جامد و نیمه جامد،آگار گفته میشود.
محیط کشت نگهداری میکروبی
محیط‌های نگهداری، توانای حفظ باکتری‌ها را تا 2 سال در کشت‌های STAB (عمقی – عمودی) یا به مدت نامحدود در کشت‌های حاوی گلیسرول دارند.
کشت‌های STAB شبیه به پلیت‌های آگار هستند، اما توسط آگار جامد در یک لوله‌آزمایش تشکیل میشوند. باکتری‌ها از طریق یک سوزن تلقیح یا نوک پیپت وارد مرکز آگار میشوند و در ناحیه سوراخ شده رشد می‌کنند. کشت‌های STAB معمولاً برای نگهداری کوتاه‌مدت یا حمل‌ونقل محیط‌های کشت استفاده میشوند.
آماده سازی محیط کشت STAB و گلیسرولی
(STAB)
- از ویال های شیشه ای (2-3 میلی لیتر) با درپوش های پیچ دار مجهز به واشر لاستیکی استفاده کنید.
- LB آگار مذاب را تا زمانی که ویال ها دو سوم پر شود اضافه کنید.
- ویال‌های نیمه پر شده (با درپوش‌های آنها که به طور شل روی آنها پیچ شده است) را به مدت 20 دقیقه با فشار 15 پوند بر مربع (1.03 بار) اتوکلاو کنید.
- ویال ها را از اتوکلاو خارج و تا رسیدن آنها به دمای اتاق صبر کنید و سپس درپوش ها را ببندید. ویال ها را تا زمان نیاز در دمای اتاق نگهداری کنید.
- برای ذخیره باکتری ها، یک کلنی منفرد و کاملاً ایزوله شده را با یک سوزن تلقیح استریل انتخاب کنید و سوزن را چندین بار از طریق آگار تا انتهای ویال وارد محیط کشت کنید.
- درپوش را عوض کرده و سفت کنید و روی ویال و درب آن را برچسب بزنید. ویال را در تاریکی و در دمای اتاق نگهداری کنید.
(گلیسرولی)
- مقدار 0.85 میلی‌لیتر از محیط کشت مایع حاوی باکتری را با 0.15 میلی‌لیتر گلیسرول استریل (استریل شده با اتوکلاو به مدت 20 دقیقه با فشار 15 پوند بر مترمربع (1.03 بار) اضافه کنید).
- برای اطمینان از پراکندگی یکنواخت گلیسرول، محیط کشت را VORTEX کنید. محیط کشت را به یک لوله نگهداری وکیوم برچسب‌دار منتقل کنید.
- محیط کشت را در اتانول یا یخ خشک یا در نیتروژن مایع منجمد کنید و سپس لوله را برای نگهداری طولانی‌مدت، به -70 درجه سانتیگراد منتقل کنید.
- برای بازیابی باکتری، سطح یخ‌زده کشت را با یک سوزن تلقیح استریل خراش دهید و سپس باکتری‌هایی را که به سوزن چسبیده‌اند، روی سطح یک صفحه آگار LB حاوی آنتی‌بیوتیک مناسب قرار دهید. کشت منجمد را به دمای 70- درجه سانتیگراد برگردانید. پلیت کشت را به مدت یک شب در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
انواع محیط کشت رشد میکروبی
به‌طورکلی محیط آگار و نوترینت براث از رایج‌ترین محیط‌های رشد میکروبی هستند، اگرچه گاهی اوقات محیط‌های تخصصی و انتخابی برای رشد میکروارگانیسم‌های میکروبی در نظر گرفته میشود که در ادامه آنها را نام می‌بریم.
محیط کشت‌های مایع، مانند نوترینت براث یا LB را اغلب با آگار مخلوط کرده و در ظروف پتری می‌ریزند تا جامد شوند. پلیت‌های حاصله، محیط جامدی را فراهم می‌کنند که میکروب‌ها را می‌توان روی آن کشت داد. ازآنجایی‌که تعداد کمی از باکتری‌ها قادر به تجزیه آگار هستند محیط کشت به‌صورت جامد می‌مانند.
ولی همچنان بسیاری از میکروب‌ها می‌توانند در محیط کشت‌های مایع متشکل از مواد مغذی مایع بدون آگار نیز رشد کنند.
این نوع از محیط کشت ها اصولا برای رشد و تکثیر جمعیت های میکروبی هتروتروف طراحی میشوند.
اقسام دیگر محیط کشت میکروبی
محیط کشت افتراقی (Differential Media):
محیط کشت تشخیصی بوده که کلنی باکتری‌های مختلف روی آن کاملاً از همدیگر متمایز می‌گردد. مانند محیط E.M.B ، M.c این محیط‌ها دارای املاح صفراوی، قند و معرف شیمیایی هستند که باکتری‌های لاکتوز مثبت بر روی آنها کلنی‌های صورتی رنگ و باکتری‌های لاکتوز منفی نظیر سالمونلا، شیگلا بر روی این محیط‌ها کلنی‌های سفیدرنگ تشکیل می‌دهند. از محیط‌های افتراقی دیگر محیط TSI ، سیمون سیترات را می‌توان نام برد. این محیط‌ها برای رشد باکتری‌های گرم – منفی روده‌ای (انتروباکتریاسه) مناسب هستند. چون وجود املاح صفراوی در محیط مانع از رشد باکتری‌های گرم مثبت در محیط میشوند.
محیط کشت اختصاصی (Special Media):
این محیط‌ها برای رشد باکتری‌های خاصی مناسب‌اند. از این محیط‌ها برای ایزوله نوع خاصی از باکتری در یک مخلوط میکروبی استفاده میشود. مانند محیط s.s آگار که برای جداکردن سالمونلا و شیگلا بکار می‌رود یا مانیتول سالت آگار که برای تشخیص گونه بیماری‌زای استافیلوکوکوس اورئوس استفاده میشود .
محیط کشت انتخابی (Selective Media):
محیط‌هایی وجود دارند که دارای یک ماده مهارکننده رشد هستند این مواد رشد تمام ارگانیسم‌ها به‌جز ارگانیسم موردنظر را مهارمی کنند. مرحله اول از رنگ‌هایی که دارای خواص ضدمیکروبی هستند استفاده میشود و در مرحله بعد استفاده از آنتی‌بیوتیک‌ها و مرحله آخر شامل واردکردن مواد ترکیبی به محیط کشت جهت فعالیت‌های متابولیکی ارگانیسم موردنظر است. ازآنجاکه این محیط‌ها جهت ارگانیسم موردنظر انتخاب شده‌اند و برای سایر ارگانیسم‌ها مضر هستند آنها را محیط‌های انتخابی می‌نامند. مثالی از این نوع محیط‌ها، محیط کشت فنیل اتیل الکل آگار است که از رشد باسیل‌های گرم منفی هوازی و بی‌هوازی اختیاری ممانعت به عمل‌آورده و به ارگانیسم‌های گرم مثبت اجازه رشد می‌دهد.
کنترل محیط کشت میکروبی
ازآنجایی‌که محیط کشت‌های میکروبی، آماده رشد و نگهداری سویه‌های مختلف باکتریایی هستند پس لازم است طی آماده‌سازی، نمونه‌گیری و نمونه‌گذاری و هنگام رشد میکروب‌های مدنظر آزمایشمان، میکروب‌های اضافی را حذف نماییم. به‌عبارت‌دیگر لازم است محیط کشتمان را انتخابی کنیم.
کنترل کیفی و کمی محیط کشت میکروبی
اگر شما پلیت یا لوله‌های محیط کشت آماده را به طور مستقیم خریداری کنید و شخصا آنها را در آزمایشگاه تهیه نکرده باشید، فرصت کمی برای کنترل کیفی آنها در اختیار دارید. اما نکته مهم در نظر گرفتن شرکت سازنده محیط کشت آماده نیز میباشد برای مثال محیط کشت های آماده تولید شده از شرکت مشهوری چون دارواش جای نگرانی باقی نمیگذارد. ولی فراتر از اعتماد به تامین کننده، شرایط حمل و نقل، شرایط نگهداری تا زمان استفاده ممکن است کیفیت را کاهش دهد.
از جمله شرایط کنترل کیفی محیط کشت‌های میکروبی می‌توان به موارد زیر اشاره نمود
- شرایط نگهداری مناسب (طبق دستور سازنده) برای محیط کشت و اجزای آن
به‌عنوان‌مثال مکمل‌های رشد مانند زرده تخم‌مرغ یا محلول‌های آنتی‌بیوتیک باید در دمای 8-2 درجه سانتیگراد نگهداری شوند درحالی‌که محیط پایه ممکن است در دمای اتاق که بیش از 30 درجه سانتیگراد نباشد نگهداری شود.
- طی فرایند آماده‌سازی محیط کشت، باید از آب یونیزه یا مقطر استفاده شود
وجود یون‌هایی مانند مس سبب افزایش رسانایی و pH میشود به طور قابل‌توجهی کیفیت محیط آماده شده را تغییر می‌دهد.
- روش صحیح استریلیزاسیون رعایت گردد
باید با استفاده از چرخه اتوکلاو طبق توصیه کارخانه انجام شود. دما و فشار نیز باید دائماً کنترل شود. مواد حساس به حرارت مانند افزودنی‌های رشد، محلول‌های قندی، گلیسرول باید به طور جداگانه با استفاده از تکنیک‌های مناسب مانند فیلتراسیون استریل شوند. حجم محیط کشت در یکبار استریلیزاسیون باید کم و در حالت ایده‌آل، تنها دو لیتر باشد. شاخص‌های استریلیزاسیون مانند تست Bowie Dick و شاخص‌های بیولوژیکی مانند اسپور Bacillus stearothermophilus باید برای نظارت بر عملکرد و کارایی مناسب اتوکلاو استفاده شود.
- کیفیت ظروف شیشه‌ای مورداستفاده برای ریختن رسانه نیز عامل مهمی است
ظروف یا لوله‌های یکبار مصرف پتری باید با اکسید اتیلن (EtO) استریل شده یا تحت اشعه گاما قرار گیرند. اگر از ظروف شیشه‌ای چند بار مصرف استفاده می‌کنید، توجه کنید که جنس شیشه آن از بوروسیلیکات باشد زیرا شیشه‌های دیگر ممکن است خواص قلیایی داشته و سبب تغییر در pH محیط کشت شوند.
- کیفیت مکمل‌ها و افزودنی‌های محیط کشت
افزودنی‌ها و مکمل‌های مختلفی در تهیه محیط کشت‌ها کاربرد دارند مانند خون، گلیسرول و محرک‌های رشد. کیفیت خون نقش مهمی در عملکرد محیط‌های حاوی خون ایفا می‌کند. غلظت، همگنی، ویسکوزیته و رنگ خون باید قبل از استفاده برای محیط کشت بررسی شود. برای سایر افزودنی‌ها باید گواهی آنالیز و شرایط استریلیزاسیون در نظر گرفته شود.
- آزمایش پارامترهای فیزیکی و شیمیایی
پارامترهای فیزیکی مانند رنگ محیط آماده شده، ضخامت، تعداد حباب‌های تشکیل شده، مقدار ناهمواری، ترک یا تبلور در محیط و پارامترهای شیمیایی مانند pH محیط نیز باید بررسی شوند. آزمایش pH را می‌توان در حین آماده‌سازی محیط قبل یا بعد از اتوکلاو با استفاده از یک pH متر خوب و کالیبره شده انجام داد.
- تست استریلیزاسیون محیط کشت میکروبی
هر محیط کشتی که با رعایت پارامترهای کنترل کیفیت تهیه شود، استریل است اما جهت اطمینان حداقل 5 تا 10٪ از یک دسته جدید آماده شده باید در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 18-24 انکوبه شود. (5٪ اگر یک دسته کوچک مانند 50 پلیت و 10٪ اگر یک دسته بزرگ 100-200 پلیت یا لوله تهیه شده). اگر پس از انکوباسیون کلونی ایجاد شود، کل دسته باید دور ریخته شود.
اگر سویه‌ی ATCC 25922 از اشرشیاکلی در پلیت MacConkey آگار استریل تلقیح شود، پس از انکوباسیون مناسب، باید کلنی‌های صورتی تخمیر لاکتوز را نشان دهد. عمدتاً اشرشیاکلی ATCC 25922، استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 25923 و سودوموناس آئروژینوزا ATCC 27853 به‌عنوان کنترل تجمعی برای آزمایش همه محیط کشت‌های میکروبی استفاده میشود.
Share It