سلول هایی که از بانک سلولی خریداری می شوند اغلب به صورت منجمد هستند. بعلاوه لازم است بعضی از سلول های مورد نیاز خود را از ذخیره موجود در تانک نیتروژن خارج کـرده و استفاده کنیم. در چنین مواقعی باید از پروتکل ذوب کردن سلول به درستی استفاده گردد تـا درصـد بیشـتری از سلول ها زنده بمانند. حفظ حیات این سـلول هـا و صـحیح بـودن روش ذوب سـلولی باعـث بازیافت سریع سلول ها و تطابق سریع تر سلول ها با محیط کشت می شود. بعضی از مواد محافظ انجماد نظیر دی متیل سولفوکساید (DMSO) در دمای بالاتر از ۴درجه سانتیگراد سمی هستند، لذا بایستی عمل ذوب کردن به سرعت انجام گیرد و سلول هـا بـه سـرعت بـا مقدار زیادی محـیط کشـت رقیـق شـده و شستشـو داده شـوند تـا اثـرات سـمی دی متیـل سولفوکساید به حداقل برسد.
روش کار پروتکل ذوب کردن سلول
۱- اطلاعات لازم برای کشت تیره سـلولی جدیـد را از روی بـرگ ضـمیمه آن مطالعـه نموده و مواد لازم را تهیه نمایید.
۲- لوله های آزمایش و فلاسک های مناسب را تهیه نموده و برچسب بزنید. برچسب ها باید شامل نام تیره سلولی، شماره پاساژ، تاریخ کشت و نام فرد کشت دهنده باشد.
۳- با رعایت اصول ایمنی مربوط به نیتروژن مایع ویال های مربوطه را از نیتـروژن مـایع خارج نموده و به آزمایشگاه کشت منتقل کنید. در صورتی که فاصله اتاق کشـت تـا محل نگهداری تانک نیتروژن نسبتاً زیاد باشد از مقداری یخ خشک جهت جلـوگیری از ذوب شدن بطئی سلول ها در مسیر انتقال استفاده نمایید.
۴- ویال را تا نیمه آن در داخل بن ماری با دمای مناسـب فـرو ببریـد. در صـورتی کـه سلول های مورد نظر مربـوط بـه تیـره هـای پسـتانداران بـود، از دمـای ۳۷درجـه سانتیگراد استفاده کنید. برای پیشگیری از آلودگی فقط قسمت تحتانی ویال را داخـل آب فرو ببرید و از فرو بردن کامل ویال در آب بن ماری خـودداری کنیـد. ویـال را داخل آب بن ماری تکان دهید تا اینکه محتویات آن ذوب شود. معمـولاً زمـان لازم برای ذوب شدن محتویات ویال حدود ۲الی ۳دقیقه است.
۵- ویال را به داخل هود منتقل کنید و روی یک تکه گاز قرار دهید. قسمت خارجی ویال را با پاشیدن اتانول %۷۰ضد عفونی نموده و در حالیکه ویال را داخل گاز نگه داشـته اید درِ ویال را باز کنید.
۶- محتویات داخل ویال را توسط پیپت پاستور چند بار به آرامی بکشید و خالی کنید تـا به خوبی مخلوط شود. سپس سریعاً کلیه محتویات را به کمک پیپت پاستور بـه یـک لوله آزمایش حاوی محیط کشتی که قبلاً به دمای بـه ۳۷درجـه سـانتیگراد رسـیده است اضافه کنید تا دی متیل سولفوکساید با محیط کشت رقیق شود. محتویات لولـه را مخلوط نموده و سانتریفیوژ کنید. مایع رویـی را دور ریختـه و بـه رسـوب سـلولی محیط کشت تازه افزوده و محتویات آن را به فلاسک مناسبی منتقل کنید.
۷- فلاسک را با توجه به تیره سلولی در دمای مناسب و غلظـت مناسـبی از دی اکسـید کربن در انکوباتور قرار دهید.
۸- پس از ۲۴ساعت سلول ها را با میکروسکوپ معکوس فاز کنتراست بررسی نمـوده و در صورت لزوم پاساژ دهید.
نکات مهم در پروتکل ذوب کردن سلول
- برای اینکه ماده محافظ انجماد رقیق شده و به سلول ها آسـیب نرسـاند بهتـر اسـت سلول ها یک بار با محیط کشت شستشو داده شوند.
- برای ذوب کردن سلول ها از انکوباتور )دمای خشک( اسـتفاده نکنیـد، زیـرا سـرعت ذوب کردن کاهش یافته و باعث آسیب سلولی و کاهش حیات سلول ها می شود.
- در مورد بعضی از سلول ها قبل از تراکم کامل بایستی پاساژ انجام شود تا مورفولوژی و خصوصیات سلول ها حفظ شود، مثلاً در صورتی که سلول های NIH-3T3چند بـار تا مرحله تراکم کامل رشد کنند خصوصیت مهار تماسی خود را از دست می دهند.
Share It