با طراحی پرایمر مناسب، بهینه سازی شرایط و تکنیک های آزمایشگاهی، PCR می تواند یک روش قدرتمند برای تکثیر اکثر توالی های هدف باشد. الگوی هدف باید با استفاده از ژل الکتروفورز به عنوان یک باند واضح و بدون هرگونه لکه دار یا سایر علائم آشکار تکثیر غیر اختصاصی در مرحله بهینه سازی مشاهده شود. باند باید از اندازه مورد انتظار مبتنی بر مقایسه با استاندارد اندازه DNA باشد که روی ژل به همراه محصول PCR لود می شود و با توالی آمپلیکون ها یا هضم محدود کننده ، تأیید می شود.
بسته به کاربرد و دلیل انجام PCR ، امکان وجود باند های اضافی بعد از تکثیر ممکن است. این ممکن است نشاندهنده یک درج (اگر باند جدید بزرگتر از محصول پیش بینی شده است) یا حذف (اگر باند جدید کوچکتر باشد) باشد.
اگر جمعیت DNA الگو برای درج یا حذف هترولوگ باشد ، هم نرمال (محصولی که برای آن طراحی شده است) و هم باند نوع واریانت ممکن است در یک واکنش واحد مشاهده شود. اگر جمعیت قالب برای درج یا حذف هموزیگوت باشد ، باند با اندازه غیر منتظره تنها محصول قابل مشاهده در ژل خواهد بود. در این مورد،توالی محصول PCR می تواند به تعیین ماهیت نوع مشاهده شده کمک کند.
| خطا | دلایل احتمالی | پیشنهادات |
| تکثیر کم یا صفر قطعه الگو | شرایط نادرست ترموسایکلر | شرایط نامناسب ترموسایکلر ممکن است به عملکرد ضعیف منجر شود. براساس توصیه های سازنده، درستی ترموسایکلر را بررسی کنید. از یک واکنش PCR تایید شده به عنوان یک کنترل برای تولید یک محصول شناخته شده خاص استفاده کنید. |
| شرایط نامناسب ترموسایکلر | درجه حرارت بهینه annealing را تعیین کنید. مطمئن شوید که مرحله hot-start فعال سازی با توجه به توصیه های شرکت تولید کننده انجام شده است. | |
| حذف یک معرف | از یک PCR شناخته شده که شامل تمام معرفهای مناسب است برای کنترل استفاده کنید. | |
| مقدار ناکافی از الگوی DNA | مقدار DNA الگو اولیه را افزایش دهید (از 1 میکروگرم در 100 میلی لیتر تجاوز نکند.) PCR طولانی به الگوی بیشتری نیاز دارد. | |
| کیفیت ضعیف الگوی DNA | الگوی نادرست ذخیره شده ممکن است منجر به مواد تخریب شده شود یا مهارکننده ها از منبع نمونه موجود باشند. رقتهای جدید از DNA الگو آماده کنید یا با استفاده از یک روش جدید نمونه آماده کنید. | |
| بهینه نبودن غلظت Mg2 + | از تیتراسیون Mg2 + با افزایش 0.5 میلی مولار استفاده کنید. | |
| از بین رفتن آنزیم یا فعالیت آن | افزایش آنزیم به مقدار 5/0 U ( آنزیم به درستی ذخیره نمی شود، یا به دلیل افزایش چرخه انجماد / ذوب آن فعالیت خود را ازدست داده است) | |
| تعداد ناکافی چرخه ها | تعداد چرخه ها را افزایش دهید | |
| طراحی پرایمر بهینه نیست | ملاحظات مربوط به طراحی آغازگر را مرور کنید | |
| محصول غیر اختصاصی ،پس زمینه ، یا وجود پرایمر- دایمر | مقدار زیاد DNA الگو | مقدار DNA الگو را کاهش دهید تا اسمیر های پس زمینه از بین بروند |
| تعداد زیاد چرخه ها | با افزایش تعداد چرخه ها محصولات پس زمینه غیر اختصاصی ممکن است افزایش یابد. تعداد کل چرخه ها را کاهش دهید تا پس زمینه کاهش یابد. | |
| توالی پرایمر بهینه نیست | ملاحظات مربوط به طراحی آغازگر را مرور کنید | |
| مقدار بیش از اندازه آنزیم | مقدار آنزیم را در واکنش کاهش دهید | |
| وجود آلودگی | یک تست کنترل بدون DNA الگو را اجرا کنید. اگر محصول یا پیش زمینه در کنترل مشهود باشد ، معرفها با محصولات یا الگوهای PCR آلوده شده اند. تمام معرف ها را جایگزین کنید. | |
| پایین بودن درجه حرارت annealing | دمای annealing را با اختلاف 2 درجه سانتیگراد افزایش دهید. | |
| پرایمر بیش از حد به واکنش اضافه شد | مقدار اضافی پرایمر موجب تولید محصولات غیراختصاصی یا پرایمر دایمر می شود. مقدار آغازگرها را تا زمانی که پرایمر-دایمر یا سایر محصولات غیر اختصاصی کاهش یابد، تیتر کنید. | |
| درجه حرارت پایین در آغاز PCR ،امکان شروع غیر اختصاصی و/ یا تشکیل پرایمر-دیمر | از یک آنزیم DNA پلیمراز hot-start کنید (به بخش PCR مراجعه کنید) |
Share It