تفاوت روش مستقیم و غیرمستقیم ایمونوفلورسانس

ایمونوفلورسانس (IF)  یا تکنیک‌های تصویربرداری سلولی به استفاده از آنتی‌بادی‌ها برای برچسب زدن به یک آنتی‌ژن هدف خاص با کمک رنگ فلورسنت (که فلوروفور یا فلوروکروم نیز نامیده می‌شود) مانند ایزوتیوسیانات فلورسئین (FITC) گفته میشود. به طور اصولا از آنتی‌بادی‌هایی که از نظر شیمیایی قابلیت اتصال به فلوروفورها را دارند در IF استفاده می‌شوند.

فلوروفور امکان تجسم توزیع هدف در نمونه را در زیر میکروسکوپ فلورسنت (به‌عنوان‌مثال میکروسکوپ‌های اپی فلوئورسانس و کان فوکال) فراهم می‌کند. ما بسته به اینکه فلوروفور به آنتی‌بادی اصلی یا ثانویه متصل است، بین دو روش IF تفاوت قائل می‌شویم:

روش‌های مستقیم و غیرمستقیم ایمونوفلورسانس

  • IF مستقیم از یک آنتی‌بادی منفرد استفاده می‌کند که علیه هدف موردنظر است. آنتی‌بادی اولیه مستقیماً با یک فلوروفور ترکیب می‌شود.
  • IF غیرمستقیم از دو آنتی‌بادی استفاده می‌کند. آنتی‌بادی اولیه غیرمتصل است و برای تشخیص از آنتی‌بادی ثانویه متصل به فلوروفور استفاده می‌شود که علیه آنتی‌بادی اولیه هدایت می‌شود.

روش‌های مستقیم و غیرمستقیم محدود به ایمونوفلورسانس نیستند. آنها همچنین به تکنیک‌های دیگری مربوط می‌شوند که به استفاده از آنتی‌بادی‌های متصل شده به فلوروفور مانند فلوسیتومتری، ELISA، وسترن‌بلات و ایمونوهیستوشیمی متکی هستند.

قیاس از نظرروش مستقیمروش غیر مستقیم
زمانپروتکلهای IF مستقیم معمولاً کوتاهتر هستند زیرا فقط به یک مرحله برچسب زدن نیاز دارنداین که شما برای شناسایی آنتی بادی اولیه مجبور به استفاده از آنتی بادی ثانویه کونژوگه هستید، نیاز به مراحل دیگری ایجاد می کند
هزینهآنتی بادی های اولیه کونژوگه معمولاً گرانتر از نمونه های غیر کونژوگه خود هستندآنتی بادی های ثانویه در مقایسه با آنتی بادی های اولیه نسبتاً ارزان هستند. همچنین صرفه جویی در هزینه بیشتر ممکن است با استفاده از همان آنتی بادی ثانویه کونژوگه برای شناسایی آنتی بادی های اولیه مختلف انجام شود
پیچیدگیمراحل کمتر، پروتکل روش های مستقیم را ساده می کند.پیچیدگی اضافه شده در روش های غیرمستقیم ممکن است ناشی از انتخاب آنتی بادی ثانویه مناسب باشد. این امر به ویژه در آزمایش های مالتی پلکس که در آن چندین آنتی بادی ثانویه ، هر کدام گونه های مختلف را هدف قرار می دهند و به رنگ های مختلف متصل می شوند ، لازم است
انعطافآنتی بادی های اولیه کونژوگه موجود در بازار ، انعطاف پذیری شما را محدود می کنندامکان استفاده از آنتی بادی های ثانویه کونژوگه مختلف انعطاف پذیری بیشتری ایجاد می کند
حساسیتممکن است سیگنال بدست آمده در روشهای مستقیم در مقایسه با روشهای غیرمستقیم ضعیف به نظر برسد زیرا تقویت سیگنال با استفاده از آنتی بادیهای ثانویه ایجاد نمی شودچندین آنتی بادی ثانویه به آنتی بادی اولیه متصل می شوند و در نتیجه سیگنال تقویت می شود
واکنش متقابل گونه هاواکنش متقابل گونه ها در روش های مستقیم به حداقل می رسد زیرا فلوروفور قبلاً به آنتی بادی اصلی متصل شده استآنتی بادی های ثانویه ممکن است با گونه های دیگری غیر از هدف واکنش متقابل داشته باشند. استفاده از آنتی بادی های ثانویه از قبل جذب شده می تواند از واکنش متقابل جلوگیری کند
پس زمینهاتصال غیر اختصاصی با استفاده از آنتی بادی های اولیه کونژوگه کاهش می یابدنمونه هایی با ایمونوگلوبولین های درون زا ممکن است پس زمینه ای بالا در روش های غیر مستقیم نشان دهند

مطالب مرتبط

None found

برچسب ها:

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.