“در تفاوت پروب و پرایمر باید گفت پروب ها نوکلئیک اسید تک رشته ای هستند که در هیبریداسیون استفاده می شوند در حالی که از آغازگرها در تکثیر استفاده می شوند.”
هیبریداسیون و تکثیر دو روش اصلی یا می توان گفت، تکنیکی هستند که تقریباً در همه نوع آزمایشگاه های ژنتیکی مولکولی استفاده می شوند. و بدان معنی است که برای انجام تکنیک های مختلف باید هیبریداسیون و تکثیر را یاد بگیریم.
همه ما در مورد پرایمرها میدانیم! یک آغازگر در طول تکثیر DNA استفاده می شود، و به سنتز رشد رشته DNA کمک می کند. حال ، نقش آغازگر در آن چیست؟ آیا در واقع می توان به افزودن نوکلئوتیدها کمک کرد؟ نه! پرایمر تنها پایان ۳’OH آزاد برای DNA پلیمراز فراهم می کند. تکثیر روشی برای سنتز DNA است که از طریق واکنش زنجیره ای پلیمراز انجام می شود، که اغلب به عنوان PCR شناخته می شود و در یک ترموسیکلر انجام می شود. با استفاده از گرادیان دما، نوع خاصی از DNA پلیمراز به نام Taq DNA پلیمراز از dNTPs ، آغازگر و بافر واکنش برای سنتز رشته DNA جدید، در شرایط in vitro استفاده می کند.
از سوی دیگر، هیبریداسیون متفاوت است. در شرایط دقیق، یک نوکلئوتید مکمل دارای برچسب (که به عنوان پروب شناخته می شود) به توالی تکمیلی دقیق آن از مولکول اسید نوکلئیک هدف وصل می شود. و اتصال توالی های اسید نوکلئیک مکمل به عنوان هیبریداسیون شناخته کی شود. خوب، همانطور که گفتیم هر دو روش از اهمیت و اشکالات خاص خود و همچنین شباهت ها و اختلافات برخوردار هستند. در مقاله حاضر، در مورد برخی از تفاوت ها و شباهت های پروب و پرایمرهای مورد استفاده در هیبریداسیون و تکثیر به ترتیب صحبت خواهیم کرد.
مباحث اصلی:
طول:
یکی از عوامل مهم در هر یک از واکنش ها، طول مولکول اسید نوکلئیک اسید است که به عنوان آغازگر یا پروب استفاده می شود. آغازگر باید از ۱۵ تا ۲۵ نوکلئوتید طول داشته باشد در حالی که پروب ها طولانی تر هستند. طول بین ۱۰۰ تا ۱۰۰۰ یا گاهی اوقات ۱۰،۰۰۰ نوکلئوتید.
کاربرد:
وظیفه اصلی پروب که از جنس DNA یا RNA است، تشخیص وجود یا عدم وجود اسید نوکلئیک هدف موجود در یک نمونه است. در حالی که وظیفه آغازگر یا آغازگر DNA ، ارائه یک پایان ۳ آزاد برای Taq DNA پلیمراز در تولید یک رشته DNA جدید است. پروب به محل هدف ما متصل می شود در حالی که آغازگر از جایی که تکثیر شروع می شود متصل می شود. از پروب ها برای شناسایی از طریق هیبریداسیون استفاده می شود، بنابراین باید یک مولکول رنگی به آن متصل شود. پروب ها معمولاً با ترکیباتی رادیواکتیو یا غیر رادیواکتیو نشاندار شده مشخص می شوند در حالی که آغازگرها دارای برچسب نیستند. به همین دلیل ، خطر کمی در رابطه با استفاده از پروب وجود دارد ، از طرف دیگر آغازگرها برای استفاده بی خطر هستند.
مکانیسم عمل:
زنجیره بلند پروب تک رشته ای در انتهای آن حاوی فلوروکروم یا یک ترکیب رادیواکتیو است. هنگامی که دنباله مکمل خود را بر روی الگوی DNA که به آن متصل می شود می یابد ، فلوروکروم آزاد می شود و فلورسانس را منتشر می کند که توسط ردیاب اندازه گیری می شود. بنابراین مقدار فلورسانس ساطع شده به طور مستقیم با هیبریداسیون پروب متناسب است.
از طرف دیگر، تحت دمای دقیق annealing، آغازگر به توالی مکمل آن متصل می شود. پس از آن، پلیمراز Taq DNA شروع به وارد کردن dNTP ها در انتهای ۳ تا رسیدن به انتهای رشته می کند. در پایان واکنش، یک مولکول جدید DNA تولید می شود.
پروب ها در آزمایش های هیبریداسیون مانند هیبریداسیون درجا ISH، فلورسانس هیبریداسیون درجا و ریزآرایه DNA استفاده می شوند. آغازگرها به طور گسترده ای، در آزمایش های PCR و توالی یابی DNA استفاده می شود.
پروب اسید نوکلئیک، در هیبریداسیون، به محل مورد نظر متصل می شود و تغییرات تعداد کپی را می یابد. همچنین می تواند به طور مستقیم بر روی کروموزوم برای شناسایی جهش ها و تغییر تعداد کپی ها به کار رود. با استفاده از روش هیبریداسیون مبتنی بر کاوشگر، تعداد تغییرات کپی بزرگتر مانند تکثیر بزرگتر، حذف، وارونگی یا درج قابل بررسی می باشد.
برخلاف این، روشهای تکثیر مبتنی بر آغازگر برای تولید آمپلیکونهای مورد نظر DNA مورد استفاده قرار می گیرند که می توانند برای توالی DNA یا ساخت کتابخانه cDNA یا کتابخانه DNA استفاده شوند. تغییرات جزئی مانند پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی SNPs که در آنها تغییر یک باز می تواند باعث جهش شود، با استفاده از روش های تقویت مبتنی بر آغازگر قابل شناسایی است.
روش هیبریداسیون در تشخیص تغییرات تعداد کپی، مطالعات مرتبط با ژنوم و غربالگری بیماری کاربرد دارد. PCR برای تشخیص بیماری های مختلف ارثی، اثر انگشت DNA و آزمایش های مهندسی ژنتیک استفاده می شود.
محدودیت ها:
محدودیت عمده روش هیبریداسیون مبتنی بر کاوشگر راندمان پایین آن است. این کاوشگر می تواند به مکانهای غیر هدف وصل شود و نتایج کاذب دهد.علاوه بر این ، روشهای مانند FISH قادر به تشخیص تغییرات جزئی نیستند، SNP ها را نمی توان با دقت تشخیص داد. جهش های جدید را نمی توان شناسایی کرد، زیرا برای ساختن پروب ها به اطلاعات توالی نیاز است.
از طرف دیگر ، محدودیت عمده روشهای PCR مبتنی بر آغازگر، عدم توانایی آن در تکثیر توالی DNA بزرگتر است. علاوه بر این ، قالب های سخت مانند الگوهای DNA غنی از GC نمی توانند به درستی تقویت شوند. اگرچه برای ساخت آغازگر، اطلاعات توالی لازم است، اما با استفاده از روش توالی DNA مانند روش ها ، تغییرات و جهش های جدید را می توان با استفاده از روش مبتنی بر آغازگر شناسایی کرد. طبق اطلاعات عملی من ، کاوشگرها در تغییرات مختلفی موجود هستند ، به عنوان مثال ، برخی از کاوشگرها مانند TaqMan بصورت خطی هستند در حالی که بعضی از آنها از نظر ساختاری متفاوت هستند – beacons مولکولی از کاوشگرهای سنجاق سری هستند. از طرف دیگر، آغازگرها مولکول های خطی هستند و تنوع شکل مولکولی برای افزایش تکثیر در دسترس نیستند.
با این وجود که پروب های اسید نوکلئیک و آغازگرها برای کاربردهای مختلف مورد استفاده قرار می گیرند، هنوز هم چندین شباهت بین هر دو وجود دارد. هر دو رشته اسید نوکلئیک یا DNA یا RNA هستند. برای طراحی کاوشگر یا پرایمر، اطلاعات توالی لازم است. هر دو می توانند به صورت مصنوعی یا با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز طراحی شوند. هر دو آغازگر و کاوشگر در Real-PCR برای تعیین کمیت اسید نوکلئیک و شناسایی میکروارگانیسم ها مورد استفاده قرار می گیرند. سطح بالایی از تخصص برای استفاده از هر دو لازم است و در نتیجه احتمال شکست واکنش در هر دو مورد بالا است. همچنین ، احتمال نتایج مثبت کاذب در هر دو روش تقویت و هیبریداسیون بالا است.
پروب و پرایمر عناصر مهمی در ژنتیک مولکولی هستند، باید از تفاوت پروب و پرایمر آگاهی داشت. تعداد زیادی نرم افزار آنلاین برای طراحی پروب ها و همچنین آغازگرها برای توالی های مختلف وجود دارد. primer 3 یکی از آنهاست. ما مقاله ای در مورد آن قرار داده ایم. شما می توانید آن را در بخش بلاگ بخوانید.
Share It