سلول باکتریایی طبیعی به عنوان فرم رویشی سلول باکتریایی شناخته می شود. هنگامی که شرایط مساعد محیطی مانند تأمین مواد مغذی، دما، آب و اکسیژن فراهم شود، می تواند آزادانه تکثیر شود. اما برخی از گروه های باکتری، در معرض شرایط نامساعد مانند کمبود مواد مغذی، تأمین ناکافی اکسیژن یا CO2، کمبود آب و رطوبت، می توانند یک پوشش محافظ برای محافظت از خود در هنگام برخورد شرایط محیطی شدید ایجاد کنند و به راحتی با این شرایط سازگار می شوند. این ساختار خاص به عنوان آندوسپور شناخته می شود.

اندوسپور یک ساختار غیر رویشی است که توسط گروهی از باکتری های متعلق به خانواده Firmicute تولید می شود. آنها دارای ویژگی های خاصی هستند که آنها را برای زنده ماندن در شرایط نامساعد برای مدت طولانی تثبیت می کند.

این ساختارشامل؛ یک مرحله خواب، یک پوشش بیرونی سخت و اشکال غیر تولید مثل به نام هاگ هستند که مقاومت زیادی در برابر درجه حرارت بالا، تابش و مواد شیمیایی مانند ضد عفونی کننده ها و اسیدها دارند. این امر آنها را قادر می سازد تا زنده بمانند بنابراین رنگ آمیزی آنها با رنگهای معمولی دشوار است و از این رو یک رنگ آمیزی مخصوص استفاده می شود که از یک رنگ مخصوص به همراه بخار و گرما استفاده می کند. این روش رنگ آمیزی به عنوان رنگ آمیزی اندوسپور شناخته می شود. این ماده به طور عمده برای شناسایی وجود آندوسپور باکتریایی و اشکال رویشی باکتریایی در سلول استفاده می شود.

نمونه هایی از باکتریهای سازنده آندوسپور عبارتند از: Clostridium spp و Bacillus spp. این باکتری ها به طور طبیعی در خاک رشد می کنند، اما با ایجاد عفونت های باکتریایی در انسان، پیامدهای بالینی زیادی دارند، از جمله کلستریدیوم تتانی باعث کزاز می شود، کلستریدیوم بوتولینوم سم بوتولین تولید می کند که باعث فلج می شود، باسیلوس سرئوس مسمومیت غذایی ایجاد می کند و باسیلوس آنتراسیس باعث ایجاد سیاه زخم در گاوها و انسان می شود.

تکنیک های رنگ آمیزی اندوسپور بر اساس انواع معرف های استفاده شده طبقه بندی می شوند:

Schaeffer Fulton Stain از رنگ مالاچیت سبز و سافرانین استفاده شده است
روش Dorner برای رنگ آمیزی آندوسپور – از رنگ Carbolfuchsin ، الکل اسیدی و محلول Nigrosin استفاده می کند)

رنگ آمیزی اندوسپور یک رنگ آمیزی افتراقی است که هدف آن شناسایی، تشخیص و افتراق یک اندوسپور از سلول رویشی (یک آندوسپور توسعه نیافته) است. هدف اصلی تشخیص وجود یا عدم وجود آندوسپور است، اما برخی از روش ها با افزایش غلظت رنگ ها، افزایش مدت زمان تثبیت گرما، استفاده از اشعه ماورا بنفش، این روش را اصلاح کرده اند. با استفاده از فناوری پیشرفته در میکروسکوپ، برخی از میکروسکوپ فازکنتراست استفاده می کنند که سریع است و مورفولوژی دقیق تری از آندوسپور باکتری تولید می کند.

اهداف رنگ آمیزی اندوسپور

برای تشخیص وجود آندوسپور.
برای شناسایی باکتریهای تولید کننده آندوسپور
برای تفاوت بین اشکال رویشی و اندوسپور

رنگ آمیزی Schaeffer Fulton

در آزمایشگاه های پایه ، ساده ترین روش رنگ آمیزی آندوسپور، تکنیک Schaeffer-Fulton است زیرا شناسایی باکتری آسان و سریع است. این روش استفاده از رنگ سبز مالاچیت (محلول قلیایی با pH 11-11.2 و رنگ محلول در آب) همراه با استفاده از حرارت بخاراست که پوشش اندوسپور را نرم می کند و اجازه نفوذ رنگ به اسپور را می دهد.

رنگ سبز مالاکیت به شکل خفیف به اسپور متصل می شود و در صورت شستشو با آب، بدون فیکس کردن، به راحتی شسته می شود و به همین دلیل استفاده از گرمای بخار برای نفوذ رنگ در اندوسپور مهم است. از آب به عنوان ماده ضد رنگ سازی برای دور نگه داشتن رنگ مالاکیت از اشکال رویشی استفاده می شود. سرانجام، استفاده از یک ضد رنگ، معرف Safranin که به عنوان رنگ ثانویه نیز شناخته می شود، زنگ آمیزی فرم های رویشی توسعه نیافته پس از شستشوی رنگ مالاکیت توسط ماده ضد رنگ سازی (آب) است.

رنگ سبز مالاچیت و Safranin به دلیل خاصیت قلیایی معرفهای سبز Malachite که به طور مثبت شارژ می شوند، در حالی که سیتوپلاسم سلول باکتریایی بازوفیل است، به خوبی در باکتری ها کار می کنند، بنابراین بین رنگ سبز مالاکیت با سلول باکتریایی جاذبه وجود دارد و این امر باعث سهولت کار می شود. تجسم سلول ها در زیر میکروسکوپ یک رنگ صورتی-قرمز برای فرم سلول های رویشی نشان میدهد، در حالی که اندوسپورها به عنوان دانه های سبز رنگ ظاهر می شوند ، زیرا رنگ سبز مالاکیت را گرفته اند.

معرف ها

رنگ سبز مالاکیت
آب (رنگ ساز)
سفرانین

تجهیزات: لام شیشه ای، حلقه تلقیح، مشعل Bunsen

روش کار

تهیه اسلاید میکروسکوپ (سازگار با سایر روشهای رنگ آمیزی اندوسپور)

لام شیشه ای را با الکل تمیز کنید تا لکه های آن پاک شود.

با استفاده از یک حلقه تلقیح استریل، دو قطره کوچک آب قرار دهید.

لوله را با كشت باكتري را در قسمت بالا شعله باز كرده و يك حلقه از كشت باكتري را از لوله جمع آوري كرده و کشت باکتری را در قطره آب روی لام آغشته کنید.

احازه دهید تا کاملا خشک شود.

اسلاید را با لکه به سمت بالا گرم کنید، آن را 3-4 بار روی شعله آبی قرار دهید. (سمت باکتری را روی شعله نگیرید) بگذارید تا خنک شود و سپس شروع به رنگ آمیزی کنید.

روش رنگ آمیزی:

لکه ها را با یک تکه کاغذ جاذب بپوشانید.

لام را روی یک رک رنگ آمیزی قرار دهید، که دارای یک حمام شیشه ای / بخار است.

کاغذ جاذب را با رنگ سبز مالاکیت بپاشید و اجازه دهید به مدت 3-5 دقیقه روی بخار بماند.

کاغذ جاذب رنگ شده را با احتیاط برداشته و دور بریزید، اجازه دهید به مدت 1-2 دقیقه خنک شود.

با کج کردن لام، لام را به آرامی با آب شیر بشویید تا آب از رنگ پاک شود. این کار برای از بین بردن رنگ اضافی از لام در هر دو طرف و همچنین برای از بین بردن. لکه های رنگی اضافی به اشکال رویشی در یک لکه ثابت شده توسط حرارت است.

برای ضد رنگ، سافرانین را به مدت 1 دقیقه اضافه کنید.

برای از بین بردن معرف سافرانین، لام را از دو طرف با آب بشویید.

قبل از قرار دادن اسلاید در مرحله میکروسکوپ، برای مشاهده با لنز غوطه وری روغن، مطمئن شوید. که پایین اسلاید خشک است، برای بزرگنمایی حداکثر 1000x.