کیت الایزا IL-33 کارمانیا

حساسیت کیت تشخیصی میزان سایتوکین IL-33 موشی حاضر به میزان ۶ پیکو گرم بر میلی‌لیتر و دقت آن Inter assay< %11, Intra assay< % 3 می‌باشد.

نمونه مورداستفاده در کیت الایزا کارمانیا

آنتی‌بادی‌های مورداستفاده شده در این کیت قادر به شناسایی IL-33 در نمونه سرم، پلاسما، مایع مغزی – نخاعی و سوپرناتانت کشت سلولی موش می‌باشند.

محتویات کیت الایزا IL-33

کیت الایزا تشخیصی میزان سایتوکین IL-33 موشی شامل موارد زیر می‌باشد:

•  پلیت کوت شده با آنتی‌بادی ضد IL-33 موشی (CN: KPG-MI33P)،
•  استاندارد (CN: KPG-MI33S)،
•  استاندارد صفر (CN: KPG-MI33Sz)،
•  آنتی‌بادی کونژوگه (CN: KPG-MI33D)،
•  CN: KPG-HA) HRP-Avidin)،
•  سوبسترا (CN: KPG-SU)،
•  محلول متوقف‌کننده (CN: KPG-ST)،
•  محلول شستشو CN: KPG-WB) 10X)،
•  بافر رقیق‌کننده (CN: KPG-EB).

مواد موردنیاز که در کیت وجود ندارد:

۱٫ دستگاه الیزا ریدر، ۲٫ آب مقطر استریل دوباره تقطیر، ۳٫ انواع سمپلر و سرسمپلر

نحوه آماده‌سازی استاندارد

برای تشخیص سایتوکین IL-33 موشی ابتدا ۵ ویال ۵۰۰ میکرولیتری استریل آماده نموده و به ویال‌ها به میزان ۲۰۰ میکرولیتر از بافر رقیق‌کننده اضافه نمایید. در ادامه این ویال‌ها را با نام استاندارد شماره ۱ تا ۵ نام‌گذاری کنید.

در ادامه به میزان ۷۰۰ میکرولیتر به ویال حاوی استاندارد (CN: KPG-MI33S) بافر رقیق‌کننده اضافه نموده و سپس به مدت ۱۵ دقیقه در دمای محیط انکوبه کنید. محلول ایجاد شده دارای ۳۰۰۰ پیکو گرم بر میلی‌لیتر از سایتوکین IL-33 می‌باشد و استاندارد شماره ۶ کیت محسوب می‌شود. به میزان ۱۰۰ میکرولیتر از ویال استاندارد شماره ۶ (CN: KPG-MI33S) به ویال استاندارد شماره ۵ منتقل کرده و به‌شدت مخلوط کرده و به مدت ۳ دقیقه انکوبه کنید. این عمل را تا استاندارد شماره ۱ ادامه دهید. دقت داشته باشید که برای رسیدن به جواب بهینه، انکوباسیون ۳ دقیقه‌ای حتماً رعایت شود. در این حالت ۱ دارای غلظت ۱۲ می‌باشد. دقت بفرمایید که استاندارد صفر (CN: KPG-MI33Sz) از قبل در کیت فراهم شده است.

 نحوه کار با کیت برای اندازه‌گیری IL-33

برای اندازه گیریسایتوکین IL-33 موشی در نمونه مورد بررسی موارد زیر را به ترتیب و بدون تغییر انجام دهید:

پلیت را از بسته موردنظر خارج کرده و در محیطی خشک به دمای اتاق برسانید.

به ویال A1 به میزان ۶۰ میکرولیتر از استاندارد شماره 6 استاندار (CN: KPG-MI33S) با غلظت ۳۰۰۰ پیکو گرم بر میلی‌لیتر)، به ویال B1 به میزان ۶۰ میکرولیتر از استاندارد شماره 5  ۱۰۰۰ پیکو گرم بر میلی‌لیتر، به ویال C1 به میزان ۶۰ میکرولیتر از استاندارد شماره 4  (۳۳۳ پیکو گرم بر میلی‌لیتر)، به ویال D1 به میزان ۶۰ میکرولیتر از استاندارد شماره 3 (۱۱۱ پیکو گرم بر میلی‌لیتر)، به ویال E1 به میزان ۶۰ میکرولیتر از استاندارد شماره 2 (۷ پیکو گرم بر میلی‌لیتر)، به ویال F1 به میزان ۶۰ میکرولیتر از استاندارد شماره  1(۱۲ پیکو گرم بر میلی‌لیتر)،  و به ویال G1 به میزان ۶۰ میکرولیتر از استاندارد صفر (CN: KPG-MI33Sz) اضافه کنید.

به میزان ۶۰ میکرولیتر به باقی ویال‌ها نمونه موردنظر را اضافه کنید.

به مدت ۲ ساعت بر روی شیکر و در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و یا ترجیحاً به مدت ۲۰ ساعت در دمای یخچال انکوبه کنید.

بعد از انکوباسیون مناسب، با استفاده از محلول شستشو پلیت‌ها را ۳ مرتبه شستشو دهید. دقت داشته باشید که محلول شستشو در غلظت ۱۰X تهیه شده است؛ بنابراین قبل از شستشو، محلول شستشو را با آب مقطر دو بار تقطیر ۱۵ برابر رقیق نمایید. دقت داشته باشید که بعد از اضافه‌کردن محلول شستشو، پلیت‌ها را به مدت تقریبی ۱ دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید و سپس تخلیه نمایید.

به میزان ۶۰ میکرولیتر از آنتی‌بادی کونژوگه به‌تمامی حفره‌ها اضافه کنید و به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق و بر روی شیکر انکوبه کنید.

بعد از انکوباسیون مناسب، با استفاده از محلول شستشو پلیت‌ها را ۳ مرتبه شستشو دهید. دقت داشته باشید که بعد از اضافه‌کردن محلول شستشو، پلیت‌ها را به مدت تقریبی ۱ دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید و سپس تخلیه نمایید.

به میزان ۶۵ میکرولیتر از محلول HRP-Avidin به‌تمامی حفره‌ها اضافه کنید و به مدت نیم ساعت در دمای اتاق و بر روی شیکر انکوبه کنید.

بعد از انکوباسیون مناسب، با استفاده از محلول شستشو پلیت‌ها را ۵ مرتبه شستشو دهید.

به میزان ۶۰ میکرولیتر از سوبسترا به‌تمامی حفره‌ها اضافه کنید و به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق و بر روی شیکر انکوبه کنید.

به میزان ۳۰ میکرولیتر از محلول متوقف‌کننده به‌تمامی حفره‌ها اضافه کنید و میزان جذب نمونه‌ها در دستگاه الیزا ریدر در طول موج ۴۰۰ نانومتر مورد اندازه‌گیری قرار گیرد.

اشکالات احتمالی در روند کار با کیت و نحوه برطرف‌کردن آن‌ها

کیت‌های شرکت کارمانیا پارس ژن چندین بار مورد کنترل کیفی قرار می‌گیرند و احتمال اشتباه در خوانش استانداردها به میزان زیادی کاهش پیدا کرده است. بااین‌وجود در برخی موارد ممکن است، همان گونه که انتظار می‌رود، استانداردها به همان ترتیبی که میزان رقت آن کاهش می‌یابد، میزان جذب نوری آن کم نشود. این خطا به چند دلیل ممکن است ایجاد شود. اولین و مهم‌ترین دلیل آن شستشو نامناسب حفره‌ها است. در صورت شستشو نامناسب و باقی‌ماندن مواد از مرحله قبل، مانند نمونه، از اتصال صحیح مواد مرحله بعدی به پلیت، مانند آنتی‌بادی کونژوگه، جلوگیری می‌شود و این آنتی‌بادی‌ها در مرحله شستشو بعدی از حفره‌ها حذف می‌شوند. شستشو نامناسب حتی ممکن است منجر به این شود که استانداردها هیچ‌گونه تفاوت جذبی نداشته باشند و همگی به یک میزان رنگ تولید کنند. دومین دلیل احتمالی، آماده‌سازی نامناسب استانداردها و یا استفاده از استانداردی که از آماده‌سازی آن زمانی بیش از ۶ ساعت گذشته باشد. سایتوکین‌ها مولکول‌هایی ناپایدار می‌باشند و برای اندازه‌گیری آن‌ها بایستی استاندارد به‌صورت تازه و در زمان نیاز آماده شود. عدم استفاده از شیکر و استفاده از سمپلرهای غیراستاندارد به دلیل دقت کم نیز می‌تواند دلیلی دیگر بر این ادعا باشد. استفاده از محلول‌هایی غیر از محلول‌های تعبیه شده در کیت (مانند استفاده از محلول شستشو از کیت‌های دیگر) به‌شدت بر میزان دقت و حساسیت کیت تأثیرگذار می‌باشد؛ بنابراین از به‌کاربردن محلول‌هایی غیر از محلول‌های این کیت خودداری فرمایید.