توضیحات

کاربرد کیت سنجش نیتریک اکساید :

نیتریک اکساید از اکسیداسیون درون‌سلولی ال – آرژنین توسط نیتریک اکساید سنتتازها تولید می‌شود. نیتریک اکساید در بسیاری از فرایندهای فیزیولوژیک از جمله تنظیم گشادی – تنگی عروق، ارتباط سلول‌های عصبی و پاسخ‌های ایمنی شرکت دارد. نیتریک اکسید به‌شدت ناپایدار است و در اثر اکسیداسیون به نیترات و نیتریت تبدیل می‌شود. این کیت برای سنجش نیتریک اکسید از طریق اندازه‌گیری میزان نیتریت به روش رنگ‌سنجی گریس کاربرد دارد.

اساس سنجش نیتریت به روش گریس :

در این روش مقدار نیتریت موجود در سوپزناتانت کشت سلول یا سرم با واکنش گریس تعیین می‌گردد. طی مرحله اول واکنش گریس، نیتریت با اسید سولفانیلیک واکنش داده و یون دی آزونیوم تولید می‌کند. در مرحله دوم واکنش، این یون با ترکیب ان-(1-نفتیل) اتیلن دی آمین جفت شده و ترکیبی از مشتقات آزو به رنگ صورتی تولید می‌کند.

محتوی کیت سنجش نیتریک اکساید :

محتویات هر بسته کیت (200-3201)برای انجام 200 تست کافی است

سایر مواد و وسایل موردنیاز:

1 – سمپلر و سرسمپلر برای حجم‌های 10 تا 1000 میکرولیتر
2 – 8 میکروتیوب برای تهیه رقت‌های مناسب از استاندارد
3 – دستگاه میکروپلیت ریدر مجهز به فیلتر 540 نانومتر و پلیت متناسب با دستگاه

تهیه رقت‌های استاندارد

۱- 8 میکروتیوب 5/1 میلی‌لیتری بردارید و A تا H نام‌گذاری کنید. مقدار 300 میکرولیتر buffer Dilution در تیوب‌های B تا H بریزید.
۲- 300 میکرولیتر از محلول استاندارد در تیوب A بریزید.

۳- 300 میکرولیتر از محلول استاندارد در تیوب B بریزید. خوب با سمپلر پیپت کنید و 300 میکرولیتر از آن را به تیوب C انتقال دهید تا غلظت استاندارد 100 میکرو مول به دست آید.

۴- همانند مرحله 3 به تهیه رقت از لوله D تا G ادامه دهید. در لوله H چیزی نریزید تا از آن برای Blank استفاده کنید.

۵- مطابق شکل مقدار 100 میکرولیتر از هر لوله را به‌صورت 3 تایی در چاهک پلیت 96 خانه بریزید.

انجام آزمایش:

1 نمونه‌های سوپرناتانت سلولی یا سرم را پس از جمع‌آوری سانتریفیوژ کنید تا ذرات ریز و سلول‌ها از آن حذف شود. سپس تا زمان جمع‌شدن کامل نمونه‌ها، آنها را در دمای 20 – درجه سانتیگراد (در صورت امکان 70 – درجه سانتیگراد) نگهداری کنید.
2 هنگام انجام آزمایش نمونه را به دمای اتاق برسانید. نمونه‌های سرم را با buffer Dilution به نسبت 2:1 رقیق کنید. از نمونه‌های سوپرناتانت سلولی یا سرم رقیق شده مقدار 100 میکرولیتر به‌صورت 3 تایی در هر چاهک پلیت 96 خانه بریزید.
3 برای تهیه معرف سنجش کیت نیتریک اکساید در 96 چاهک)یکپلیت(، مقدار 5 میلی‌لیتر از A Reagent را با مقدار 5 میلی‌لیتر از ReagentB در bottle Mixing مخلوط کنید و به‌آرامی هم بزنید تا محلول یکنواخت شود ولی کف نکند.

دقت کنید هنگام برداشتن محلول، A Reagent و B Reagent در ظروف اصلی با هم مخلوط نشود.
دقت کنید که اگر می‌خواهید در چند نوبت سنجش نیتریک اکساید را انجام دهید؛ یکباره همه A Reagent و B Reagent را با هم مخلوط نکنید. چون پس از مخلوط شدن، به‌شرط نگهداری در تاریکی تنها یک ماه قابل‌استفاده خواهند بود.

4 به هر چاهک دارای نمونه استاندارد، Blank و تست، 100 میکرولیتر از معرف را اضافه کنید. با دست یا با استفاده از شیکر کمی تکان دهید تا یکنواخت شود.
5 با استفاده از میکروپلیت ریدر، جذب نمونه‌ها را در 570 نانومتر بخوانید.

نگهداری کیت سنجش نیتریک اکساید :

کیت را در دمای 4 درجه سانتیگراد و در محل تاریک نگهداری کنید.

• رفرنس مطلب

مطالب مرتبط

• کیت سنجش نیتریک اکساید (NO) کارمانیا پارس ژن