محیط کشت بلاد آگار – Blood Agar

محیط کشت Blood Agar Base که به نام محیط کشت بلاد آگار بیس نیز شناخته می‌شود، مناسب برای شناسایی و کشت بسیاری از باکتری‌های سخت رشد، خصوصاً گونه‌های بیماری‌زا و نیز بررسی واکنش همولیز آنها می‌باشد. محیط کشت میکروبی Blood Agar Base حاوی مواد مغذی و ۵٪ خون گوسفند است. بعضی از باکتری‌ها اگزوآنزیم هایی تولید می‌کنند که گلبول‌های قرمز را لیز می‌کنند و هموگلوبین را کاهش می‌دهند که همولیزین‌ها نامیده می‌شود. باکتری‌ها می‌توانند انواع مختلف همولیزین تولید کنند.

ترکیبات محیط کشت بلاد آگار و نقش آنها

نیتروژن، کربن ، ویتامین  و نشاسته موجود در محیط کشت بلاد آگار، به وسیله هضم آنزیمی بافت حیوانی و کازئین  و هم چنین نشاسته با اضافه‌کردن عصاره مخمر برای رشد و تکثیر زیاد باکتری‌ها به محیط اضافه می‌شود. علت افزودن کلرید سدیم، آگار و لاکتوزبه این محیط کشت به ترتیب به دلایل زیر میباشد.

• کلرید سدیم: حفظ تعادل اسمزی
• آگار: حفظ حالت جامد بودن محیط کشت
• لاکتوز: ایفا نمودن نقش بافر دی پتاسیم فسفات

آماده‌سازی محیط  Blood Agar Base

• ۴۰ گرم از پودر محیط را در یک لیتر آب مقطر حل کنید. به‌آرامی حرارت دهید تا محیط کاملاً حل شود
• در دمای ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو کنید.
• پس از اتوکلاو محیط را تا دمای ۵۰-۴۵ درجه سانتی‌گراد خنک کرده و به مقدار ۵-۴٪ خون دفیبرینه به آن افزوده و به‌خوبی مخلوط کنید.
• قبل از افزودن خون، محیط آماده شده شفاف و به رنگ زرد – قهوه‌ای می‌باشد.
• پلیت‌های آماده شده بلاد آگار را می‌توان به مدت سه ماه در یخچال نگهداری کرد.

آماده‌سازی محیط کشت بلاد آگار جوشیده (چاکلت آگار)

• پس از افزودن خود به محیط پایه بلاد آگار، محیط کشت را به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۸۰ درجه سانتی‌گراد جوشانده و هم زده شود تا رنگ آن قهوه‌ای شود (رنگ شکلاتی).

فرایند آزمایش Blood Agar Base

• محیط کشت بلاد آگار را طبق دستور عمل توضیح داده شده تهیه کنید. مقدار ۵٪ خون دفیبرینه گوسفندی به محیط اضافه کنید.
• نمونه موردنظر را بر روی پلیت کشت داده و در دمای ۲±۳۵ سانتی‌گراد به مدت ۲۴-۱۸ ساعت گرماگذاری کنید.
• لازم به ذکر است جهت رشد باکتری‌های استرپتوکوک، محیط‌های کشت باید در انکوباتور حاوی ۵-۳٪ دی‌اکسیدکربن گرماگذاری شود.

نتیجه و تفسیر Blood Agar Base

مورفولوژی کلنی باکتری‌ها بر روی بلاد آگار حاوی ۵٪ خون گوسفندی به شرح زیر می‌باشد:

• کلنی‌های باکتری‌های همولیتیک استرپتوکوک شفاف یا کدر و به رنگ خاکستری بوده که به اندازه‌های کوچک (قطر ۱ میلی‌متر) یا بزرگ و موکوئیدی (۴-۲ میلی‌متر) دیده می‌شوند که در اطراف آن‌ها هاله‌ای از همولیز تشکیل می‌شود. رنگ‌آمیزی گرم بایستی انجام شده و خصوصیات ماکروسکوپی بررسی شود. برخی ارگانیسم‌های دیگر مانند لیستریاها، برخی کورینه باکتری‌ها، استافیلوکوک‌های همولیتیک، اشریشیا کلی و سودوموناس نیز واکنش همولیز دارند.
• کلنی باکتری‌های پنوموکوک معمولاً پهن، نرم، شفاف و خاکستری‌رنگ بوده که در برخی مواقع هاله باریک سبزرنگی از همولیز (همولیز آلفا)، در اطراف کلنی‌های موکوئیدی آنها دیده می‌شود.
• استافیلوکوک‌ها کلنی‌هایی کدر و به رنگ زرد – طلایی داشته که می‌تواند همراه یا بدون هاله همولیز بتا باشند.
• باکتری‌های لیستریا به‌واسطه ظاهر میکروسکوپی میله‌ای شکل در رنگ‌آمیزی و داشتن حرکت در دمای اتاق، شناسایی می‌شوند. در اطراف کلنی‌های این باکتری هاله باریکی از بتا همولیز دیده می‌شود.

کنترل کیفی Blood Agar Base

• ظاهر محیط دهیدراته: پودری و یکنواخت
• ظاهر محیط پایه و بدون خون آماده: زرد مایل به قهوه‌ای روشن
• ظاهر محیط آماده همراه با ۵٪ خون گوسفندی: قرمز آلبالویی، کدر
• نتیجه کشت باکتری در شرایط هوازی پس از گرماگذاری در دمای ۲±۳۵ سانتی‌گراد به مدت ۲۴-۱۸ ساعت

همولیز و انواع مختلف آن

در قسمت زیر انواع مختلف همولیز در بلاد آگار مورد بررسی قرار می‌گیرد:

• بتا همولیزین به طور کامل سلول‌های قرمز و هموگلوبین را تجزیه می‌کند و یک منطقه واضح را در اطراف رشد باکتری‌ها ایجاد می‌کند. چنین نتایجی به‌عنوان بتا همولیز (بتا همولیز) نامیده می‌شود.
•  آلفا همولیزین تا حدی گلبول‌های قرمز را تجزیه می‌کند و رنگ سبز به جا می‌گذارد. این به‌عنوان α-hemolysis (آلفا همولیز) نامیده می‌شود. رنگ سبز به علت حضور biliverdin است که یک محصول جانبی از تجزیه هموگلوبین است. اگر ارگانیسم همولیزین تولید نمی‌کند و سلول‌های خونی را تجزیه نمی‌کند، هیچ شفاف‌سازی رخ نمی‌دهد.
•  γ-hemolysis (گاما همولیز) نامیده می‌شود.

همولیزین‌های تولید شده توسط استرپتوکوک‌ها در محیط بی‌هوازی بهتر عمل می‌کنند. ازاین‌رو، روش استاندارد بررسی آن ایجاد یک صفحه خونی است و سپس لوپ را در بلاد آگار بچرخانید تا منطقه‌ای با غلظت اکسیژن پایین ایجاد کنید که در آن استرپتولیزین ها می‌توانند سلول‌های خونی را به طور مؤثرتر تجزیه کنند.

نکات تکمیلی Blood Agar Base

• پودر محیط داخل قوطی کاملاً دربسته و در دمای زیر ۳۰ درجه سانتی‌گراد و محیط آماده در دمای ۸-۲ درجه سانتی‌گراد نگهداری شود. بهترین زمان استفاده تا قبل از تاریخ انقضای درج شده بر روی برچسب محصول است.
• کلنی‌های باکتری Haemophilus haemolyticus  بر روی بلاد آگار همراه با خون اسب یا خرگوش، همولیز بتا داشته و برای تشخیص و تمایز آن از استرپتوکوک‌ها باید از روش دیگری استفاده کرد. برای حل این مشکل، استفاده از خون گوسفندی پیشنهاد می‌شود؛ زیرا خون گوسفندی فاقد مقادیر کافی نوکلئوتیدهای پیریدین بوده و به این دلیل باکتری Haemophilus haemolyticus  بر روی چنین محیطی رشد نمی‌کند.