تریپسین – EDTA

محلول تریپسین ادتا که به نام Tripsine EDTA نیز شناخته می شود، مناسب جدا کردن سلول ها از بستر کشت ( پتری دیش یا فلاسک کشت) و همچنین تفکیک و جدا کردن آنها می باشد. تریپسین، سرین پروتئازی است که از پانکراس خوک گرفته می‌شود. این آنزیم یک پروتئین تک زنجیره حاوی 223 اسیدآمینه که محل اصلی فعالیت آن زنجیره جانبی دارای لیزین و آرژنین با بار مثبت می باشد. تریپسین غالباً زنجیره‌های پپتیدی را از سمت عامل کربوکسیل لیزین و آرژنین می‌شکند مگر اینکه بعد از آنها پرولین قرار داشته باشد.

ویژگی محیط کشت تریپسین EDTA

• EDTA (اتیلن دی آمین تترا استیک اسید) اغلب برای افزایش فعالیت آنزیماتیک به تریپسین افزوده می‌شود. EDTA از طریق خنثی‌کردن یون‌های کلسیم و منیزیم که باعث افزایش اتصال سلول به سلول می‌شوند، عمل می‌کند.
• مهارکننده‌های سرین پروتئاز، پروتئین‌هایی مانند DFP، TLCK، APMSF، AEBSEF  و آپروتینین، تریپسین را مهار می‌کنند.
• تریپسین می‌تواند باعث شکست پیوندهای استری و آمیدی در مشتقات سنتتیک اسیدهای آمینه شود.

کاربرد محیط کشت تریپسین EDTA

• تریپسین به طور شایع برای جداکردن سلول‌های چسبیده به فلاسک محیط کشت و همچنین جداکردن سلول‌ها از هم استفاده می‌شود.
• کمک به جداسازی سلول‌های سرطانی روده بزرگ انسان که در محیط RPMI 1640 همراه با FPSکشت داده شده اند.
• آزادسازی آنزیمی سلول‌های فیبروبلاست موش متصل به داربست، در طی کشت سلول برای ارزیابی تأثیر چندین درمان اصلاح شده داربست و الیاف غیر ‌بافته لاکتید پلی (L/D)قابل‌استفاده است.

نکات تکمیلی

• ازآنجایی‌که سلول‌های زنده در محیط اصلی خود قرار ندارند, مواد مغذی موردنیاز این سلول‌ها به طور مرتب توسط تجهیزات مخصوص پایش شده و به آزمایشگر اطلاع داده می‌شود. لزوم استفاده از مکمل‌های کشت, غنی و استریل به‌منظور حصول نتایج حداکثری و سازگاری سلول‌ها با محیط کشت امری غیرقابل‌انکار است.
• غلظت تریپسین موردنیاز برای جداکردن سلول‌ها از سوبسترا، ابتدائاً به نوع سلول، سن کشت، و تراکم کشت‌های سلول بستگی دارد.
•  محصول به دلیل اینکه بر روی یخ خشک منتقل می‌شود ممکن است مقدار قابل‌توجهی دی‌اکسیدکربن در داخل بسته باشد. این دی‌اکسیدکربن ممکن است به محلول نفوذ کرده و pH آن را کمی کاهش داده و باعث تغییر رنگ آن از صورتی به نارنجی شود. محلول نارنجی هنوز قابل‌استفاده است، یا می‌توان با بی‌کربنات سدیم pH آن را تنظیم کرد.
• انکوبه کردن مدت طولانی سلول‌ها با غلظت‌های خیلی بالای تریپسین می‌تواند باعث آسیب به غشا سلولی و در نتیجه مرگ سلول شود.
• محلول کردن تریپسین یا رقیق‌سازی آن از یک محلول غلیظ، باید با یک محلول نمک بافری فاقد کلسیم یا منیزیم انجام شود.
• محلول‌های تریپسین باید شفاف و عاری از هرگونه ذرات معلق باشد. درصورتی‌که محلول کدر بوده یا حاوی ذراتی معلق و یا رسوب است از آن استفاده نکنید.
• در دمای 20- نگه‌داری شود و در دمای 2 تا 8 درجه به مدت 2 هفته پایدار است.
• فریز و دفریز مکرر محصول موجب کاهش فعالیت آنزیمی می‌شود.