وسترن بلات (ایمنو بلات)

برای انتقال پروتئین های تفکیک شده بر روی ژل به غشاء نیتروسلولز از تکنیک وسترن بلات استفاده می‌شود. هدف از این روش شناسایی اختصاصی پروتئین هاست، ابتدا پروتئین‌های تفکیک شده بر روی ژل الکتروفورز به غشاء منتقل می‌شود و سپس از پادتنها (آنتی بادی‌ها) برای مشخص کردن پروتئین‌ها استفاده می‌شود.

روش وسترن بلات در مقایسه با تست الایزا اختصاصی‌تر است ولی از حساسیت کمتری برخوردار است و چون آزمایشی نسبتاً گران محسوب می‌شود، به عنوان اولین آزمایش انجام نمی‌گیرد و بیشتر در تأیید نتایج مثبت شده تست الایزا بکار می‌رود. تست وسترن بلات در همراهی با تست الایزا٬ بیش از ۹۹٪ مورد اطمینان خواهد بود.

این روش آزمایشگاهی دارای ۳ مرحله است :

  1. انتقال پروتئین به ژل الکتروفورز
  2. انتقال پروتئین از ژل به غشاء نیتروسلولز
  3. شناسایی پروتئین اختصاصی
  • معرفی وسترن بلات
  • مواد و محلول ها
  • لیز نمونه ( از بافت و کشت سلولی)
  • آماده سازی نمونه
  • بارگذاری و اجرای ژل
  • رنگ آمیزی آنتی بادی
  • لینک های مفید

معرفی وسترن بلات

وسترن بلات یک روش برای تجسم پروتئین هایی است که با الکتروفورز ژل جداسازی شده اند. این ژل در کنار یک کاغذ نیتروسلولوز یا PVDF (پلی وینیل فلوراید) قرار دارد و جریان الکتریکی پروتئین ها را از ژل به غشا منتقل می کند. سپس غشا توسط آنتی بادی های اختصاصی برای پروتئین مورد بررسی هدف گیری شود و با استفاده از آنتی بادی های ثانویه و واکنش های رنگی مشخص شود.

مواد و محلول ها

محلول ها و بافر ها در آزمایش وسترن بلات می توانند در دمای 4 درجه سانتیگراد برای چندین هفته نگهداری شوند یا تقسیم بندی شوند و در دمای -20 درجه سانتیگراد تا یک سال نگهداری شوند.

بافر NP-40

  • 150 mM NaCl
  • 0% NP-40 قابل تعویض با 0.1% Triton X-100
  • 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
  • Protease inhibitors

بافر RIPA  (radioimmunoprecipitation assay buffer)

  • 150 mM NaCl
  • 0% NP-40 یا 0.1% Triton X-100
  • 5% sodium deoxycholate
  • 1% SDS (sodium dodecyl sulphate)
  • 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
  • Protease inhibitors

بافر Tris-HCl

  • 20 mM Tris-HCl
  • Protease inhibitors

بافر های Running, transfer  و blocking

بافر Laemmli 2X/ بافر لودینگ

  • 4% SDS
  • 10% 2-mercaptoethanol
  • 20% glycerol
  • 004% bromophenol blue
  • 125 M Tris-HCl
  • PH بررسی شود و در 6.8 تنظیم شود.

بافر Running  (Tris-Glycine/SDS)

  • 25 mM Tris base
  • 190 mM glycine
  • 1% SDS
  • PH بررسی شود و در 8.3 تنظیم شود.

بافر انتقال (wet)

  • 25 mM Tris base
  • 190 mM glycine
  • 20% methanol
  • PH بررسی شود و در 8.3 تنظیم شود.

برای پروتئین های بزرگتر از 80 kDa، توصیه می شود SDS در غلظت نهایی 0.1٪ باشد.

 

بافر انتقال (semi-dry)

  • 48 mM Tris
  • 39 mM glycine
  • 20% methanol
  • 04% SDS

 

بافر Blocking

3-5٪ شیر یا BSA (آلبومین سرم گاوی)

شیر یا BSA را به بافر TBST اضافه کنید خوب مخلوط کنید و فیلتر کنید. عدم فیلتر شدن می تواند منجر به لکه دار شدن شود، که در آن دانه های کوچک تیره، در طول رنگ آمیزی، بلاتینگ را آلوده می کنند.

لیز نمونه

– آماده سازی لیزسلولی از کشت سلولی
  1. ظرف کشت سلولی را بر روی یخ قرار دهید و سلولها را با PBS سرد بشوید.
  2. حذف PBS، سپس بافر لیز سرد(1 میلی لیتر برای هر107 سلول / 100 میلی لیتر مساحت / 150 سانتیمترمربع فلاسک،یا 0.5 میلی لیتر برای هر 5×106 سلول / 60 میلی لیتر ظرف / 75 سانتی مترمربع فلاسک) اضافه کنید.
  3. سلولهای چسبنده را با استفاده از یک اسکرپر سلولی پلاستیکی سرداز ظرف خارج کنید، سپس به آرامی سوسپانسیون سلولی را به یک لوله میکروتیوب سرد انتقال دهید.یا می توانید سلول ها را به وسیله تریپسینه کردن وشستشو با استفاده از PBS قبل از اضافه کردن بافر لیز در یک لوله میکروتیوب اماده کنید.
  4. همزدن ثابت به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد .

5- سانتریفیوژ در  دمای 4 درجه سانتیگراد. ممکن است مجبور باشید نیرو و زمان سانتریفوژ را بسته به نوع سلول تغییر دهید. بر اساس دستورالعمل 20 دقیقه در 12000 دور در دقیقه است اما این برای هر آزمایش جداگانه تعیین شود (لکوسیت ها نیاز به سانتریفیوژ بسیار آرام تری دارند).

  1. به آرامی لوله ها را از سانتریفیوژ برداشته و روی یخ قرار دهید، اسوپ رویی را برداشته و در یک لوله جدید روی یخ نگه دارید و پلت سلولی را دور بریزید.
-آماده سازی لیزسلولی از بافت

1 بافت مورد نظر را با استفاده از ابزارهای تمیز، ترجیحا بر روی یخ و با سرعت بالا برای جلوگیری از تخریب نوسط پروتئاز ها، جدا کنید.

  1. بافت را در لوله های میکروتویب با انتهای گرد یا لوله های Eppendorf قرار دهید و در نیتروژن مایع غوطه ور کنید تا منجمد شود. نمونه ها را در دمای -80 درجه سانتیگراد نگهداری کنید تا بعدا استفاده شود یا برای استفاده همان زمان روی یخ نگه دارید. برای یک قطعه حدود 5 میلی گرم از بافت، 300 میکرو لیتر بافر لیز سرد را به سرعت به لوله اضافه کنید، و با یک هموژنایزر الکتریکی همگن سازی کنید، تیغه را دو بار با بافر لیز بشویید سپس همزدن را برای 2 ساعت در 4 درجه سانتیگراد قرار دهید. حجم بافر لیز باید با مقدار بافت تعیین شود. عصاره پروتئین نباید بیش از حد رقیق شود تا مقدار زیادی پروتئین ازدست نرود و نیاز به لود حجم زیادی از نمونه ها بر روی ژل نباشد. حداقل غلظت 0.1 میلی گرم بر میلی لیتر است، غلظت مطلوب 1 تا 5 میلی گرم / میلی لیتر است.
  2. سانتریفیوژ به مدت 20 دقیقه در 12000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد . لوله ها را از سانتریفوژ به آرامی برداشته و روی یخ قرار دهید، سوپ رویی را برداشته و در یک میکروتیوب جدید بریزید وروی یخ نگه دارید. پلت را دور بریزید.
آماده سازی نمونه
  1. یک حجم کوچک از لیزات را برای انجام آزمایش کمیت سنجی پروتئین بردارید. غلظت پروتئین برای هر لیزات سلول را تعیین کنید.
  2. تعیین مقدار پروتئین برای بارگذاری و اضافه کردن حجم مشابه از بافر 2X Laemmli sample . ما توصیه می کنیم که با استفاده از روش زیر، نمونه ها را آماده و denaturing کنید، مگر آنکه بر اساس دستورالعمل آنتی بادی اختصاصی شما باید از شرایط بدون کاهش و غیر تضعیف استفاده کرد.
  3. برای کاهش و انحلال نمونه های خود، لیزات هر سلول را در بافر نمونه در دمای 100 درجه سانتیگراد برای مدت 5 دقیقه بجوشانید. لیزیت ها را می توان در دمای -20 درجه سانتی گراد برای استفاده آینده تقسیم بندی کرد.

بارگذاری و اجرای ژل

  1. مقدار مساوی پروتئین را درون چاه های ژل SDS-PAGE همراه با نشانگر وزن مولکولی بارگذاری کنید. مقدار 20 تا 30 میکروگرم پروتئین total از لیزیت سلولی و بافت هموژن شده یا 10 تا 100 نانوگرم پروتئین خالص را لود کنید.
  2. ژل را برای 1-2 ساعت در 100 ولت ران کنید. زمان و ولتاژ ممکن است نیاز به بهینه سازی داشته باشد. توصیه می کنیم به دنبال دستورالعمل سازنده باشید. ژل کاهشی باید مورد استفاده قرار گیرد، مگردر شرایط غیر کاهشی که بر اساس دستورالعمل داده های آنتی بادی توصیه می شود.

درصد ژل مورد نیاز بسته به سایز پروتئین مورد نظر شما بستگی دارد(ژل گرادیان نیز می تواند مورد استفاده قرار گیرد.):

سایز پروتئیندرصد ژل
4–40 kDa20%
12–45 kDa15%
10–70 kDa12.5%
15–100 kDa10%
25–100 kDa8%

انتقال پروتئین از ژل به غشا

غشاء می تواند نیتروسلولز یا PVDF باشد PVDF را با متانول 1 دقیقه فعال کنید و با بافر انتقال شستشو دهید قبل از آماده سازی. زمان و ولتاژ انتقال ممکن است به بهینه سازی نیاز داشته باشد. توصیه می کنیم به دنبال دستورالعمل سازنده باشید. انتقال درست پروتئین به غشا را می توان با استفاده از رنگ آمیزی پانسو  S قبل از مرحله بلاکینگ بررسی نمود.

 

رنگ آمیزی آنتی بادی

  1. غشاء را برای 1 ساعت در دمای اتاق یا یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد با استفاده از بافر بلاکینگ، بلاک کنید.
  2. غشاء را با رقت مناسب از آنتی بادی اولیه در بافر بلاکینگ انکوبه کنید. توصیه می کنیم انکوباسیون یک شبه را در دمای 4 درجه سانتیگراد انجام دهید. شرایط دیگر را می توان بهینه سازی کرد.
  3. غشاء را سه بار با TBST بشویید، هر کدام 5 دقیقه.
  4. غشاء را با رقت توصیه شده از آنتی بادی های ثانویه کونژوگه در بافر بلاکینگ در دمای اتاق به مدت 1 ساعت انکوبه کنید.
  5. غشاء را سه بار با TBST بشویید، هر کدام 5 دقیقه.
  6. برای سیگنال بهتر، توصیه های سازنده کیت را دنبال کنید. برای جلوگیری از واکنش های اضافه غشا را در پوشش پلاستیکی شفاف قرار دهید.
  7. دریافت تصویر با استفاده از تکنیک های اتاق تاریک برای chemiluminescence، و یا روش های اسکن تصویر نرمال برای تشخیص رنگی(DAB).

لینک های مفید

برچسب ها:

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.