استخراج پروتئین های پریپلاسمی

سلول های باکتریایی توسط یک ساختار پیچیده و چند لایه ای به نام پاکت سلولی محافظت می شوند. در باکتری های گرم منفی، پاکت سلولی از یک غشای سیتوپلاسمی داخلی، یک دیواره سلولی پپتیدوگلیکانی و یک غشای خارجی حاوی لیپوپلی ساکارید تشکیل شده است که لایه پپتیدوگلیکان را احاطه کرده است. غشاهای درونی و بیرونی یک فضای آبی را به نام “پری پلاسما” تعریف می کنند. پریپلاسم توجه بیشتری به عنوان محلی برای بیان پروتئین نوترکیب به دست آورده است، به دلیل تشکیل پیوند دی سولفید است. علاوه بر این، periplasm  تنها حاوی مقدار کمی از پروتئین های کل سلولی است. بنابراين بيان در اين بخش از سلول نیازمند خالص سازی  عصاره  پري پلاسمي مي باشد با استفاده از پروتوکل استخراج پروتئین های پریپلاسمی.

بسیاری از روش های مکانیکی یا شیمیایی ناشی از غشای خارجی و دیواره سلولی به منظور رهاسازی محتوای پری پلاسمی، یا برای خالص سازی پروتئین های نوترکیب برای مطالعات پروتئومیک ایجاد شده اند. در بعضی از این روش ها مانند شوک اسمزی، استفاده از لیزوزیم EDTA، هضم پلی متیسین و استخراج کلروفرم، غنی سازی پروتئین های نوترکیب در عصاره ها را تا 90٪ بهبود پروتئین های هدف را نشان می دهد. با این حال، این روش ها، که برای استخراج حداکثر پروتئین های نوترکیب، بهینه سازی شده، مقدار قابل توجهی از پروتئین سیتوپلاسمی را نیز آزاد می کند. پروتئین های پری پلاسمی تنها حدود 4-16٪ از کل پروتئین سلولی در Escherichia coli را تشکیل می دهند. بنابراين، پروتئين هاي سيتوپلاسمي در مقدار و اندازه نسبت یه پریپلاسمی تقريبا ده برابر هستند.

روش شوک اسمزی برای استخراج پروتئینهای پریپلاسمی

این روش به منظور استخراج پروتئینهای موجود در پریپلاسم باکتری و بدون آسیب به سلول باکتری و شکستن سلول انجام می شود.

1. حجم100میلی لیتر ازکشت القا شده باکتری در شتاب g3000 و دمای 4 درجه ی سانتیگرادبه مدت 20 دقیقه سانتریفوژ شده و فاز رویی دور ریخته شد.
2. رسوب بدست آمده از نمونه ها در 15 میلی لیتر بافرTSE (8  Tris pH 50 میلی مولار، سوکروز 20%، EDTA 1 میلی مولار) و 1Xcocktail protease inhibitor سوسپانسون شد و به مدت 30 دقیقه روی یخ قرار گرفت.
3. سپس نمونه ها مطابق مرحله یک سانتریفوژ شدند و فاز رویی به طورکامل دور ریخته شد.
4. رسوب سلول ها در این مرحله در 5/1 میلی لیتر محلول از MgCl₂ 5 میلی مولار سرد حل شدند و به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه به آرامی شیک شدند.
5. درنهایت سلول ها با سرعت حداکثرسانتریفوژ شدند و فاز رویی به عنوان مایع حاوی پروتئین های پریپلاسمی در میکروتیوب جدید جمع آوری شد وبه همراه رسوب حاصل برای آنالیز بعدی در فریزر -20 درجه نگهداری شدند.

 

لینک های مفید

• دانلود پروتوکل فارسی و انگلیسی

• مطالعه بیشتر در مورد استخراج پروتئین های پریپلاسمی