تست Checkerboard
برای استفاده از روش الایزا به منظور بررسی پاسخ آنتی بادی علیه آنتی ژن مورد نظر، ابتدا باید شرایط بهینه برای غلظت آنتی ژن و رقت آنتی بادی تعیین گردد. در شرایط بهینه نتایج الایزا،کمترین میزان پس زمینه و بیشترین اختلاف در عدد OD نمونه های مثبت با گروه کنترل منفی را نشان خواهد داد. برای تعیین این شرایط بهینه از تست Checkerboard استفاده می شود. برای این منظور فاکتورهای غلظت آنتی ژن (از علظت پایین تا بالا برای مثال در این پروتوکل از 5 تا 250 ) در چاهک های افقی 1تا 7 به صورت duplicate کوت می شود و رقت ها ی سرم یا آنتی بادی در چاهک های عمودی (برای مثال در این پروتوکل از 1:400 تا 1:3200) مطابق زیر انجام می شود.
تست الایزا با رقت بهینه و مشخص شده توسط شرکت سازنده از آنتی بادی دوم انجام می شود. پس از اتمام واکنش و قرار دادن پلیت ها در دستگاه اسپکتروفوتومتر OD هر چاهک مشخص خواهد شد. و با توجه به منحنی های رسم شده مناسب ترین غلظت و رقت به ترتیب برای آنتی ژن و آنتی بادی اختصاصی علیه آن یا سرم مشخص می شود.
| ng/ml | Ag
Ab |
|||||||
| C— | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 | 160 | 250 | |
| 8 | 7 | 6 | 5 | 4 | 3 | 2 | 1 | |
| 1:400 | ||||||||
| 1:800 | ||||||||
| 1:1600 | ||||||||
| 1:3200 | ||||||||
-
روش تست الایزا
مقادیر محلول های تهیه شده مطابق زیر برای یک پلیت الایزا می باشند و روش کار جهت بررسی Total IgG می باشد
- تهیه غلظت مناسب از آنتی ژن مورد نظر از 5 تا 250 (ng/ml) توسط بافر Coating تهیه شده و در چاهک ها مطابق شکل زیر اضافه می شود. و برای مدت 16 ساعت در دمای 4 درجه نگهداری شود.
- شستشو با 200 میکرولیتر بافر شستشو سه بار به مدت 5 دقیقه و خشک کردن کامل چاهک ها.
- 100 میکرولیتر بافر بلاکینگ به چاهک های مورد نظر اضافه شده و برای 1 ساعت در دمای آزمایشگاه انکوبه شوند.
- پس از طی مدت انکوباسیون و سه بار شستشوی چاهک ها به مدت 5 دقیقه، سرم یا انتی بادی علیه آنتی ژن که با رقت 1:400 تا 1:3200 در بافر incubation تهیه شده به هر چاهک 100 میکرولیتر اضافه شود و برای 90 دقیقه در دمای آزمایشگاه انکوبه شود.
- پس از طی مدت انکوباسیون و سه بار شستشوی چاهک ها به مدت 5 دقیقه،آنتی بادی ثانویه anti-mouse IgG antibody peroxidase با رقت1:25000 (بر اساس دستور العمل شرکت سازنده). به چاهک ها به مقدار 100 میکرولیتر اضافه شده و برای 90 دقیقه در دمای آزمایشگاه انکوبه شود.
- پس از سه بار شستشوی چاهک ها به مدت 5 دقیقه، به هر چاهک به مقدار 100 میکرولیتر سوبسترای TMB (Tetramethylbenzidine) به عنوان سوبسترای آنزیم پراکسیداز برای شناسایی آنتی بادی های ثانویه متصل مانده به ترکیب آنتی بادی اول و آنتی ژن اضافه شده که واکنش رنگی حاصل با H2SO4 2 نرمال متوقف شود ودر طول موج 450 نانومتر، OD چاهک ها اندازه گیری گردد.
با توجه به نتایج بدست آمده مناسبترین غلظت برای آنتی ژن و سرم جهت استفاده در ارزیابی پاسخ ایمنی مشخص خواهد شد. رقت بهینه آنتی ژن و سرم برای بررسی آنتی بادی IgG و زیرکلاس های آن غلظتی از آنتی ژن و سرم می باشد که پس زمینه نداشته باشد و بالاترین اختلاف OD را با گروه کنترل منفی نشان دهد.
Share It