تمامی اصول و واکنش‌گرهایی که برای یک PCR معمولی نیاز است در تکنیک Real time PCR ( ریل تایم پی سی آر ) هم بکار می‌رود، اما یک گزارشگر فلورسنت نیز در واکنش حضور دارد. این گزارش‌گرها به گونه‌ای طراحی می‌شوند که در صورت تکثیر DNA نور تولید کنند. لذا افزایش شدت نور ثبت شده در دستگاه با میزان محصول بدست آمده نسبت مستقیم دارد. با ادامه یافتن PCR شدت فلورسنت رو به افزایش می‌گذارد.
به اولین چرخه‌ای که شدت فلورسنت بیشتر از خط پایه باشد چرخۀ آستانه یا CT گویند. عدد CT با مقدار الگوی اولیه رابطۀ معنی‌دار دارد و از روی آن می‌توان مقدار mRNA اولیه را مورد تخمین قرار داد.

به عبارت دیگر در فاز اولیه مرحله تصاعدی مقدار فلورسنت افزایش می یابد تا به آستانهای می رسد، که به مقدارمشخصی از سطح background بالاتر است، این چرخه ( سیکلی ازPCR که قطعه تکثیر از حد آستانه عبور می کند) به عنوان CT شناخته می شود.

در ادامه با مفاهیمی آشنا می شوید که به درک بهتر پروتکل انجام Real time PCR ( ریل تایم پی سی آر ) به شما کمک می کند.

مراحل کار Real time PCR ( ریل تایم پی سی آر ) در پروتکل:

فاز اول The baseline region ; با وجود اینکه محصول دو رشته ای وجود دارد ولی نور آن قابل ردیابی نیست.

فاز دوم The exponential phase ; محصول دو رشته ای در هر چرخه دو برابر می شود و رشد نمایی مربوط
به واکنش شروع می شود.

فاز سوم The liner phase; ترکیبات واکنش و کارایی آنها روبه اتمام است.

فاز چهارم The plateau phase; ترکیبات واکنش از بین می روند و افزایش در میزان فلورسنت مشاهده نمی شود.در پروتکل انجام Real time PCR ( ریل تایم پی سی آر )واکنش بصورت تک مرحله ای ویا ۲ مرحله ای انجام میشود.

در واکنش یک مرحله ای سنتز cDNA و تکثیر آن در یک تیوب انجام می شود. در واکنش ۲مرحله ای نسخه برداری معکوس و تکثیر در تیوب های جداگانه صورت می گیرد. در روش تک مرحله ای تغییرات آزمایشگاهی به حداقل می رسد ولی حساسیت کمتری دارد. در روش ۲مرحله ای هم امکان سنجش قسمتهای مختلف یک DNA هدف وجود دارد و حذف پرایمر دایمر با دستکاری دمای Annealing آسانتر است گر چه ممکن است شانس آلودگی را بیشتر کند ولی دارای مزیت های بیشتری نسبت به واکنش تک مرحله ای است.

پروتکل فارسی و انگلیسی را می توانید در پایان متن دانلود کنید.

روش‌های شناسایی PCR Real time

در سالیان اخیر پیشرفت‌های تکنیکی زیادی اتفاق افتاده و ابزار زیادی در این روش بکار رفته که مهمترین آن شاید اختراع دستگاه‌های چند کاناله باشد. این دستگاه‌ها قادرند به صورت همزمان چندین طول موج نوری متفاوت را تابانیده و بازتابش آن را ثبت نمایند. دراین تکنیک ، برای تعیین غلظت DNA از رنگهای فلورسانس و یا شاخص های الیگونوکلئوتیدی فلورسانس استفاده میشودکه به برخی از مهمترین آنها اشاره میشود:

۱)رنگهای فلورسنت متصل شونده بهDNA

شاید متداول ترین رنگ مورد استفاده در این تکنیک سایبرگرین I باشد. این رنگ اینترکاله وفلورسنت، به شیارهای کوچک DNA دورشته‌ای متصل می‌شود و باجذب طول موج ۴۹۸ نانومتر، نور ۵۲۲ نانومتری را ساطع می‌کند که توسط دستگاه ثبت می‌شود.
سایبرگرین I به الگوهای تک رشته‌ای متصل نمی‌شود لذا در این موارد بازتاب ضعیفی دارد. در طی چرخه های PCR که محصول دو رشته ای تولید میشود، رنگ به آنها متصل می شود و بنابراین افزایش شدت نور فلورسنت با غلظت dsDNA متناسب است.

سایبرگرین I یک رنگ غیر اختصاصی است لذا برای تمامی آزمایشات قابل استفاده است و این مسئله یک مزیت به شمار می‌آید.

از دیگر مزایای این رنگ می‌توان به ارزانی، عدم تداخل با پلیمرازها، ساده و غیر سمی بودن آن اشاره کرد. همانگونه که گفتیم این رنگ غیر اختصاصی است و این مزیت، مهمترین عیب آن را نیز شامل می‌شود چرا که نمی‌توان وجود محصولات غیر اختصاصی یا پرایمر دایمر را به کمک این رنگ شناسایی کرد. البته استفاده از نمودار منحنی ذوب در دستگاه‌های امروزی این مشکل را تا حدودی مرتفع کرده است.

۲) پروب‌های فلورسنت

پروب‌ها بر خلاف سایبرگرین I بر اساس تشخیص اختصاصی توالی محصول کار می‌کنند. پروب‌ها معمولاًیک رنگ فلورسنس‌زا (Reporter) و یک رنگ خاموش کننده (Quencher) دارند. معمولاً دستگاه‌ها بازتابش رنگ فلورنس‌زا را بررسی می‌نمایند حضور خاموش کننده در نزدیکی موقعیت فلورسنس‌زا موجب جذب نور آن و خاموش شدن آن می‌شود لذا در این حالت بازتابشی در دستگاه ثبت نمی‌شود.از این پروب ها در روشهای زیر استفاده می شود.

Hydrolysis probe

نمونه بارز این روش پروبهای Taqman هستند همچنین این روش به عنوان سنجش’۵ نوکلئازی نیزشناخته می شود. پروب فلورسنت هیدرولیز شده ودر نتیجه در محصول PCR تشخیص داده می شود. پروب با ترادف اختصاصی با رنگ گزارش دهنده (reporter) در انتهای’۵ و خاموش کننده (quencher) در انتهای ‘۳ قرار داده می شود.

روش استفاده از پروبهای TaqMan بر دو حقیقت استوار است اول آن که از یک آنزیم DNA پلیمراز با ویژگی اگزونوکلئازی ‘۵ به ‘ ۳ استفاده شود و دیگر این که پروب‌ اولیگونوکلئوتیدی حاوی دو نشان رنگی(یکی فلورسنس‌زا و دیگری خاموش کننده) است و تنها زمانی سیگنال می‌دهد که بافعالیت اگزونوکلئازی شکسته شود. پروب مورد نظر از طریق توالی اختصاصی به محصولات
متصل می‌شود.

Hybridization probe

در اینجا دو پروب وجود دارد یک پروب با یک فلورفور دهنده و پروب دیگر با یک رنگ گیرنده در اتصال است. در حین واکنش PCR پروب ها طوری به الگو هیبرید می شوند که از سر دم در اتصال قرار می گیرند. در این جهت انرژی پروب دهنده رنگ پروب گیرنده را تحریک می کند که منجر به ساطع شدن نور با طول موج بالاتری می شود. نسبت بین فلورسنس دهنده به فلورسنس گیرنده در طول واکنش افزایش می یابد که متناسب با DNA تکثیری است، اگر DNA تکثیر نشود هیچنوری قابل ساطع نیست زیرا پروب ها به DNA متصل نشده اند.

Hairpin probe

بی‌کون‌های مولکولی (Molecular beacons)سادهترین پروبهای سنجاق سری هستند که شامل یک ناحیه با ترادف اختصاصی (ناحیه لوپ) که دو طرف آن توالیهای معکوس تکراری وجود دارد. رنگهای Reporter و quencher به دو انتهای مولکول متصل میشوند. این دو وقتی با هم در تماس هستند، انرژی انتقالی رزنانسی آنها کاهش مییابد.

پروبها با ساختار سنجاق سری منجر به اختصاصیت بیشتر نسبت به پروبهای خطی میشوند. کمپلکس Probe-Target باید از لحاظ ترمودینامیکی پایداری بیشتری نسبت به ساختار سنجاق سری پروب به تنهایی داشته باشند. زیرا در کمپلکس Probe-Target ترکیب پایدارتری با استفاده از همولوژی بازها تشکیل میشود.

این ویژگی به خصوص در تشخیص آللها بکار میرود. مهمترین مزیت بی‌کن‌های مولکولی این است که در جریان واکنش دست نخورده باقی می‌مانند و در چرخه‌های بعدی مجدداً هیبرید می‌شوند. میزان تشعشع فلورسنس درمرحلۀ هیبریداسیون، با غلظت ژن هدف متناسب است .

منحنی ذوب

برای اینکه بفهمیم PCR درست کار کرده است باید از منحنی ذوب استفاده کنیم. به این ترتیب که از دمای پایین تر از دمای اتصال تا دمای بالاتراز ۹۵ درجه سانتی گراد را در نظر گرفته وبرنامه مربوط به آن را به دستگاه می دهیم، تا به ازای هر نیم درجه سانتی گراد لامپ روشن شود و شدت جذب فلورسنت را قرائت کند این باعث می شود که برای تمام قطعات تکثیر شده پیک جذب رسم شود. به این ترتیب در صورت وجود آلودگی از طریق دیدن پیک جذب آن را شناسایی می کنیم. در دمایی پایین پیک های که رسم می شود مربوط به دایمر آغازگر است و آخرین پیک مربوط به قطعه موردنظر ماست.

آنالیزهای کمی درReal time PCR

دو روش عمده برای بررسی کمی در time PCR Real وجود دارد:

روش منحنی استاندارد (مقایسۀ مطلق)

در این روش از نمونۀ RNA یا DNA با غلظت مشخص برای رسم منحنی استاندارد استفاده می‌شود. غلظت RNA یا DNA استاندارد با اسپکتروفوتومتر (nm260) تعیین می‌شود و سپس از روی وزن مولکولی نمونه به تعداد نسخه‌های آن تبدیل می‌شود.

استانداردهای غلظتی ژن‌های معروف به صورت تجاری قابل خریداری است هرچند که بسیار گران قیمتند. از نمونه های استاندارد سری رقعت تعیین کرده و همراه با نمونه هدف در دستگاه Real-time PCR قرار می دهیم با استفاده از Ct که دستگاه برای هر رقت به ما می دهد یک منحنی رسم کرده که X آن رقت یا تعداد کپی از ژن و Y آن CT باشد، نمودار به دست امده یک نمودار خطی است که با قرار دادن عدد نمونه هدف در نمودار غلظت یا تعداد کپی آن نیز بدست می آید. ترجیحا طول قطعه استاندارد مساوی با طول قطعه هدف باشد.

روش آستانه نسبی (مقایسۀ نسبی)

برای حذف نوسانات مقادیر RNA وارد شده در واکنش و خطاهای عملکرد دستگاه‌ها و فرد از استانداردهای داخلی استفاده می‌شود. این استانداردها باید در همۀ بافت‌ها بیان ثابت داشته باشند و آزمایش ما نباید بیان آن را نسبت به نمونۀ کنترل تغییر دهد. بدین منظور از ژن بتا اکتین و GAPDH استفاده می‌شود. به این ژن‌ها Housekeeping گویند. بیان این ژن ها ثابت است که با مقایسه نمونه تیمار شده با شاهد و کنترل داخلی می توان کاهش یا افزایش بیان را مشاهده کرد.

تشخیص پلی مرفیسم توسط Real time PCR

استفاده از این تکنیک اجازه تعیین کمیت نواحی چند شکلی DNA و یا تعیین ژنوتیپ پلیمرفیسم یک نقطهای SNPS) Single nucleotide polymorphism,) جدید را به ما می دهد. مانیتور کردن همزمان پروسه تکثیر و تعیین ژنوتیپ با استفاده از هیبریداسیون پروبها و با آنالیز منحنی ذوب امکان پذیر می شود.

موتاسیون نقطه ای بوسیله آنالیز منحنی ذوب تشخیص داده میشود. دمای بحرانی Tm که در آن DNAتک رشته ای میشود یک شناساگر برای وجود یا عدم وجود موتاسیون میباشد.
پروب اختصاصی برای ناحیه موتانت تهیه می شود در دمای پایین پروب به ناحیه های غیر اختصاصی متصل می گردد و با افزایش دما پروب اختصاصی تر عمل می کند، منحنی ذوب حاصل از این واکنش را آنالیز می کنیم تا متوجه وجود یا عدم وجود موتاسیون شویم.

نتیجه گیری

قبل از اندازه‌گیری کمی باید کارایی PCR سنجیده شود. کیفیت و طراحی پرایمرها مهمترین عامل اثر گذار بر کارایی PCR است. علاوه بر آن نوع دستگاه، نوع کیت مصرفی، پروتکل آزمایش نیز بر کارایی PCR اثر میگذارند.

بدلیل اینکه امروزه روشReal time PCR یک روش معمول در برآورد میزان بیان ژن است این مطلب ضروری است که استفاده کنندگان از جنبههای مختلف این روش آگاهی داشته باشند و در صورتیکه شرایط مختلف این روش کنترل شونده باشند یکی از بهترین روشهای آزمایشگاهی با حساسیت بالا، کارا، سریع و تکرار پذیر در تعیین میزان بیان ژنهای مختلف است.