تفاوت انواع کیت استخراج اسیدنوکلئیک

کیت‌های استخراج اسید نوکلئیک جدای از متد و روش استخراج، همگی یک هدف دارند، آن هم تخلیص و جداسازی DNA و RNA با کمترین مقدار آسیب به ژنوم موجود در آن‌هاست. ازآنجایی‌که استخراج اسید نوکلئیک کاری تخصصی و نیازمند استانداردهای خاص جهانی است، شرکت‌های ایرانی تولیدکننده این اقلام، تحت‌نظر سازمان غذا و دارو ایران فعالیت کرده و به خدمت‌رسانی به آزمایشگاه‌های علوم زیستی مشغول می‌باشند. شرکت‌های تولیدکننده کیت‌های استخراج اسید نوکلئیک در ایران ضمن اخذ پروانه‌های بهداشتی و گواهی‌نامه‌های ISO، سبد محصولات متنوعی را مانند رقبای خارجی خود عرضه کرده‌اند. ازاین‌رو در این مقاله به برسی تفاوت‌های کیت‌های استخراج از منظر متد، پروتکل و روش استفاده از آنها می‌پردازیم. همچنین شما را به مطالعه مقاله “اساس عملکرد کیتهای استخراج RNA – DNA” دعوت می‌نماییم. با ما همراه باشید.

فهرست

کیت‌های استخراج اسید نوکلئیک را می‌توان به دو نوع استخراج پروکاریوتی و یوکاریوتی تقسیم نمود. کیت‌های استخراج پروکاریوتی، فقط برای استخراج اسیدهای نوکلئیک سوش‌های باکتریایی مانند ای. کلای کاربرد دارند. ازآنجایی‌که ژنوم اصلی باکتری‌ها (پلازمید و ژنوم متابولیسم اصلی) DNA می‌باشد، بنابراین تمام کیت‌های استخراج باکتریایی بر مبنای استخراج و تخلیص DNA باکتری‌ها طراحی و تولید می‌شوند. اما لازم به ذکر است که کیت‌های استخراج پلازمید و DNA اصلی باکتری به طور اختصاصی و جدا از هم نیز تولید می‌شوند، این امر به دلیل تحقیقات خاص (مانند ایجاد DNA نوترکیب) بر روی پلازمید باکتری‌ها می‌باشد.

انواع روش‌های تخریب و لیز سلولی

تخریب به روش فیزیکی

روش‌های فیزیکی شامل خردکردن نمونه و تخریب دیواره بافتی و سلولی است. یک روش متداول تخریب فیزیکی، انجماد و آسیاب کردن نمونه‌ها با هاون در زیر نیتروژن مایع است تا یک ماده پودری تهیه شود. سپس در معرض شرایط لیز شیمیایی یا آنزیمی قرار می‌گیرد. دستگاه‌های آسیاب دو مدل دستی ساده یا خودکار دارند. این دستگاه‌ها خروجی عملکرد خود را در پلیت‌های 96 چاهکه قرار می‌دهند. روش‌های فیزیکی اغلب برای مواد ساختاریافته‌تر، مانند بافت‌ها یا گیاهان مورداستفاده استفاده قرار می‌گیرد. نوع دیگری از تخریب فیزیکی به کمک دستگاه‌های دیگر از کوبیدن یا تکان دادن در حضور دانه‌های فلزی یا سرامیکی برای ازهم‌گسیختگی سلول‌ها یا بافت‌ها، یا فراصوت برای شکستن بافت‌ها و لیز سلول‌ها استفاده می‌کنند.

لیز سلولی به روش سنتی همراه با نیتروژن مایع و هاون کوبی

لیز کردن به روش‌ شیمیایی

روش‌های شیمیایی را می‌توان به‌تنهایی برای سلول‌های کشت بافت یا در ترکیب با روش‌های دیگر استفاده کرد. ازهم‌گسیختگی سلولی با عوامل مختلفی که غشاهای سلولی را تخریب می‌کنند و پروتئین‌ها را دناتوره می‌کنند، انجام می‌شود. مواد شیمیایی که معمولاً مورداستفاده قرار می‌گیرند شامل مواد شوینده (مانند SDS) و کائوتروپ‌ها (مانند نمک‌های گوانیدین و محلول‌های قلیایی) هستند.

لیز کردن به روش‌ آنزیمی

روش‌های آنزیمی اغلب با مواد اولیه ساختاریافته‌تر در ترکیب با روش‌های دیگر برای بافت‌ها، مواد گیاهی، باکتری‌ها و مخمرها استفاده می‌شود. آنزیم‌های مورداستفاده برای ازبین‌بردن بافت‌ها و دیواره‌های سلولی سخت کمک می‌کنند. بسته به نمونه، آنزیم‌ها شامل موارد زیر است: لیزوزیم، زیمولاز، لیتیکاز، پروتئیناز K، کلاژناز، لیپاز و غیره. استفاده از آنزیم تخریبی تمیز و با کمترین آسیب به DNA انجام می‌دهد، اما در مقایسه با سایر روش‌های لیز سلولی هزینه بالاتری دارد.

همچنین کیت‌های استخراج DNA برحسب نوع تخلیص سازی به سه نوع ستونی، رسوبی، دارای حامل RNA و مگنت تقسیم می‌شوند. در این مقاله ضمن معرفی ترتیبی و مفصل هر روش برای انواع کیت‌های استخراج به برسی روش جدید مگنت نیز می‌پردازیم.

کیت استخراج DNA به روش تخلیص ستونی

این کیت‌ها برای استخراج سریع، ساده و باکیفیت DNA طراحی شده‌اند. خلوص و کیفیت بالای DNA استخراج شده توسط این روش امکان انجام کلیه آزمایش‌های پایین‌دست از جمله برش با آنزیم‌های محدودکننده (restriction enzymes)، رونوشت برداری ازروی پلاسمید در شرایط خارج سلولی و ترانسفکشن سلول‌های یوکاریوتی را فراهم می‌سازد. در این کیت‌ها برای آزادسازی و بازیابی DNA (یا elution) از ستون استفاده می‌شود.

شماتیک کلی از مراحل تخلیص DNA با ستون سیلیکا

ستون استخراج چیست و از چه ساخته شده؟

کیت‌های استخراج ستونی DNA که با استفاده از ذرات سیلیکاژل کار می‌کنند به روشی محبوب برای جداسازی DNA تبدیل شده‌ است. پس لازم است نحوه کار این ستون‌ها را مورد برسی قرار دهیم. نحوه خالص‌سازی ستون‌های سیلیکا به برهم‌کنش بارهای سیلیکون موجود در این ستون‌ها با DNA و بافرهای مورداستفاده در این کیت می‌باشد. DNA در حضور غلظت‌های بالای نمک‌های کائوتروفیک (chaotrophic) به ستون‌های سیلیسی متصل می‌شود و پس از شستشو باقی‌مانده‌های ذرات سلولی توسط بافر مخصوص، DNA از غشای سیلیس جدا شده و در آب یا بافر کم‌نمک نگه‌داری می‌شود. این روش خالص‌سازی، اصلاح‌شده‌ی متد مهره‌های شیشه‌ای Vogelstein و Gillespie در سال 1979 می‌باشد. آن‌ها به دنبال یک روش سریع، راحت و غیرسمی برای استخراج DNA بودند که بازده بالایی از DNA خالص را تولید کند.

نمایی از واکنش برگشت پذیر ستون سیلیکا، نمک کائوتروفیک و DNA

لازم به ذکر است که بازده استخراج ستونی، به‌طورکلی 50% تا 75% از مواد اولیه (کل DNA موجود در سلول) می‌باشد. به نظر می‌رسد این روش با قطعات DNA بزرگ‌تر از 500 جفت باز بهتر عمل می‌کند، زیرا برخی از قطعات کوتاه‌تر ممکن است به طور محکم و برگشت‌ناپذیر به غشاهای سیلیکا متصل شوند. مزیت دیگر ستون‌های سیلیسی نسبت به مهره‌های شیشه‌ای (وگلشتاین و گیلسپی، 1979) این است که برش قطعات DNA بزرگ‌تر از 3 تا 10 کیلو جفت باز کم می‌باشد و بخش‌های زیادی از ژنوم سالم می‌مانند.

مکانیسم اتصال و انفصال DNA به غشای سیلیکونی چیست؟

اصل خالص‌سازی ماتریس‌های سیلیکا بر اساس میل ترکیبی بالای DNA با بار منفی نسبت به ذرات سیلیسی با بار مثبت است. DNA از طریق بر همکنش اتصال هیدروژنی با یک ماتریکس آب‌دوست کم‌توان سیلیس، باوجود نمک کائوتروفیک غلیظ (معمولاً یدید سدیم، پرکلرات سدیم، تیوسیانات گوانیدینیم) به سیلیس متصل می‌شود. سدیم نقش یک پل کاتیونی را ایفا می‌کند که یون‌های اکسیژن با بار منفی در سیلیس را تحت شرایط غلظت‌های بالای نمکی (pH ≤ 7.00) جذب می‌کند.

جذب پلاسمید و DNA کروموزومی بر روی سطح سیلیس به عواملی مانند قدرت یونی، دما، pH و اندازه DNA بستگی دارد. به بیان دیگر نیروهای الکترواستاتیک بین مولکولی، کم‌آبی DNA و سطح سیلیس، تشکیل پیوند هیدروژنی بین مولکولی در لایه تماس سیلیس – DNA، عامل اصلی اتصال DNA هستند. در غلظت‌های بالای نمک، اسیدهای نوکلئیک به طور انتخابی به غشاهای سیلیکا متصل می‌شوند درحالی‌که سایر آلاینده‌ها، عمدتاً پروتئین‌ها، از غشاها عبور می‌کنند.

به‌طورکلی، گوانیدینیم تیوسیانات و گوانیدینیم هیدروکلراید برای اتصال اسیدهای نوکلئیک به غشاهای سیلیس استفاده می‌شود. گوانیدینیم تیوسیانات در غلظت 4M و 6M بهترین عملکرد را دارد، درحالی‌که گوانیدینیم هیدروکلراید در غلظت‌های بالاتر (بیش از 6M) استفاده می‌شود. به‌منظور کنترل pH معرف اتصال، از بافرهای استات سدیم و Tris-HCl از pH 6.00 تا 7.50 استفاده می‌شود. به نظر می‌رسد اتصال قطعات کوچک‌تر و اتصال ترجیحی RNA به DNA تابعی از pH و ویژگی‌های غشاء باشد. راندمان اتصال در حضور اتانول به طور قابل‌توجهی بهبود می‌یابد. یدید سدیم و پرکلرات سدیم نیز به میزان کمتری برای اتصال به اسید نوکلئیک استفاده می‌شود. گوانیدینیم تیوسیانات یک دناتوره کننده پروتئین عالی است ازاین‌رو در غیرفعال‌کردن نوکلئازها بسیار مؤثر است. بااین‌حال، مواد شوینده مانند سدیم دودسیل سولفات با گواندینیم تیوسینات سازگار نیستند، اما با گوانیدینیم هیدروکلراید به‌خوبی کار می‌کنند.

کیت استخراج DNA به روش تخلیص رسوبی

خالص‌سازی DNA با استفاده از روش رسوبی (لیز قلیایی) با ایجاد اختلال در ساختار سلولی برای ایجاد لیز، جداسازی DNA، بقایای سلولی و سایر مواد نامحلول سلولی انجام می‌شود.

به کمک یک بافر لیز کننده (مانند سدیم ددسیل سولفات (SDS) و هیدروکسید سدیم) دیواره باکتری لیز می‌شود و DNA از سلول آزاد می‌شود. اجزا اضافی مانند RNA و پروتئین‌ها با کمک سانتریفیوژ و آنزیم‌های مخصوص در نهایت حذف می‌شود. در باکتری‌ها پس از سانتریفیوژ، DNA ژنومی و پروتئین‌های رسوب شده یک گلوله در کف ویال تشکیل می‌دهند درحالی‌که DNA پلاسمید محلول باقی می‌ماند. DNA پلاسمید باقیمانده در مایع رویی را می‌توان با اتانول رسوب داد یا با استفاده از سیلیکاژل یا مخلوط فنل – کلروفرم خالص کرد.

اما در سلول‌های یوکاریوتی که استخراج کروموزوم مدنظر است داستان کمی فرق دارد. پس از ایجاد لیز سلولی، بقایای سلولی و پروتئین‌ها با استفاده از محلول نمک با غلظت بالا رسوب می‌کنند. غلظت بالای نمک باعث می‌شود که پروتئین‌ها از محلول خارج شوند و سپس سانتریفیوژ اسید نوکلئیک محلول را از بقایای سلولی و پروتئین رسوب داده شده جدا می‌کند. سپس DNA با افزودن ایزوپروپانول به محلول نمک با غلظت بالا رسوب می‌کند. این امر مولکول‌های بزرگ DNA ژنومی را از محلول خارج می‌کند، درحالی‌که قطعات کوچک‌تر RNA محلول باقی می‌مانند. سپس DNA نامحلول پلت شده و از طریق سانتریفیوژ از نمک، ایزوپروپانول و قطعات RNA جدا می‌شود. شستشوی بعدی با اتانول، نمک باقیمانده را حذف می‌کند و تبخیر را افزایش می‌دهد. در نهایت، گلوله DNA دوباره در یک بافر آبی مانند Tris-EDTA یا آب بدون نوکلئاز معلق می‌شود و پس از حل شدن، برای استفاده در کاربردهای پایین‌دستی آماده است.

کیت استخراج DNA به روش تخلیص مگنت

کیت‌های استخراج به روش مگنت یک روش ساده و قابل‌اعتماد برای خالص‌سازی DNA ژنومی، پلاسمید و میتوکندری هستند. تحت شرایط بهینه، DNA به طور انتخابی به سطح دانه‌های مغناطیسی متصل می‌شود، درحالی‌که سایر آلاینده‌ها در محلول باقی می‌مانند. سپس DNA خالص شده را می‌توان مستقیماً در کاربردهای زیست‌شناسی مولکولی مانند توالی‌یابی یا برش با آنزیم‌های محدودکننده استفاده کرد. مزیت اصلی این روش عدم نیاز به سانتریفیوژ یا منیفولدهای خلاء است که می‌تواند در بسیاری از فرایندهای خودکار مورداستفاده قرار گیرد. جداسازی می‌تواند به‌صورت دستی، نیمه اتوماتیک و یا تمام اتوماتیک در پلیت‌های 24، 96 و 384 چاهکی انجام شود. تجهیزات لازم برای این نوع از تخلیص سازی شامل کیت‌های خالص‌سازی bead (مگنت)، سیستم‌های پردازش ذرات مغناطیسی، جداکننده‌های مغناطیسی، لوله‌ها، ستون‌ها و فلاسک‌ها می‌باشد.

طرح واره ایی از استخراج DNA مبتنی بر مهره مغناطیسی با استفاده از دانه های Sera-Mag

ویژگی دانه‌های مغناطیسی (Magnetic beads) کیت‌های تخلیص چیست؟

دانه‌های مغناطیسی از ذرات ریز (20 تا 30 نانومتر) اکسیدهای آهن مانند مگنتیت (Fe3O4) تشکیل شده‌اند که به آنها خاصیت سوپر پارامغناطیس می‌دهد. مهره‌های سوپر پارامغناطیس با فرومغناطیس‌های رایج‌تر متفاوت هستند، زیرا آنها رفتار مغناطیسی را فقط در حضور یک میدان مغناطیسی خارجی از خود نشان می‌دهند. این ویژگی به‌اندازه کوچک ذرات موجود در مهره‌ها بستگی دارد و این امکان را فراهم می‌کند که دانه‌ها به همراه هر چیزی که به آن متصل می‌شوند به‌صورت معلق از هم جدا شوند. ازآنجایی‌که آنها خارج از میدان مغناطیسی یکدیگر را جذب نمی‌کنند، می‌توان آنها را بدون نگرانی در مورد تجمع ناخواسته استفاده کرد.

انواع مختلفی از مهره‌های مغناطیسی وجود دارد که هر یک ویژگی‌های خاص خود را دارا می‌باشند. پوشش‌های سطحی و مواد شیمیایی مختلف به هر نوع مهره خاصیت اتصال به خصوصی را به هریک از آن‌ها می‌دهد که می‌توان از آن برای جداسازی مغناطیسی (جداسازی و خالص‌سازی) اسیدهای نوکلئیک، پروتئین‌ها یا سایر مولکول‌های زیستی به روشی آسان، مؤثر و مقیاس‌پذیر استفاده کرد. یک مزیت کلیدی برای استفاده از دانه‌های مغناطیسی این است که می‌توانید اسیدهای نوکلئیک و سایر مولکول‌های زیستی را مستقیماً از یک نمونه خام و از انواع مختلف بافت با حداقل پردازش جدا کرد.

استخراج DNA با مهره مغناطیسی چگونه است؟

اولین‌بار در سال 1990 میلادی از مهره‌های مغناطیسی در خالص‌سازی اسید نوکلئیک استفاده شد، اما این اختراع در آن زمان تغییر زیادی در عرصه زیست مولکولی ایجاد نکرد. زیرا این فرایند نیاز به‌نوعی بافر که به طور برگشت‌پذیر دانه‌های مغناطیسی را متصل و جدا کند. این بافر به طور فراگیر در دسترس دانشمندان آن دهه وجود نداشت.

پس از افزودن و اتصال مهره‌های مغناطیسی به محلول حاوی DNA، یک میدان مغناطیسی خارجی را به لوله‌آزمایش اعمال می‌کنیم. این امر سبب می‌شود، مهره‌های مغناطیسی همراه با DNA به کناره لوله کشیده شده و این ترکیب در گوشه‌ای فیکس می‌شود. درحالی‌که مهره‌ها بی‌حرکت هستند، DNA متصل به مهره در طول مراحل شستشو حفظ می‌شود. با افزودن بافر شستشو و حذف میدان مغناطیسی، DNA به‌عنوان یک نمونه خالص شده آزاد می‌شود و آماده برای کمی‌سازی و تجزیه‌وتحلیل‌های بعدی است.

این نوع از استخراج نیاز به خلأ یا سانتریفیوژ را از بین می‌برد و سبب می‌شود که تنش یا نیروهای برشی روی مولکول‌های هدف (DNA یا  RNA) به حداقل برسد. همچنین مراحل و معرف‌های کمتری نسبت به سایر پروتکل‌های استخراج DNA نیاز دارد، و در پلیت‌های 24، 96 و 384 چاهکه قابل اتوماسیون است؛ بنابراین، به‌زودی شاهد این خواهیم بود که استفاده از روش استخراج با مهره‌های مغناطیسی از سایر روش‌ها پیشی بگیرد.

کیت استخراج DNA دارای حامل RNA

استخراج DNA با کمک ستون‌های سیلیس چه به‌صورت دستی چه به‌صورت اتوماتیک اگر در حجم‌های بسیار کم باشد نیازمند افزودن RNA حامل به محلول نمک کائوتروفیک می‌باشد. این امر منجر به افزایش DNA قابل ریکاوری در مقایسه با عدم وجود حامل RNA  می‌شود. اما چطور؟

هنگام خالص‌سازی مقادیر کمی از DNA با استفاده از فناوری سیلیکا، افزودن RNA یا DNA حامل، بازیابی DNA را افزایش می‌دهد. حامل از اتصال غیرقابل‌برگشت مقدار کمی اسید نوکلئیک هدف موجود در نمونه جلوگیری می‌کند. حامل مورداستفاده باید یک اسید نوکلئیک، دارای اندازه حدوداً (> 200nt) باشد تا به غشای سیلیکا متصل شود. افزودن اسیدهای نوکلئیک حامل، مقدار DNA یا RNA استخراج شده از نمونه را افزایش می‌دهد. به‌خصوص هنگامی که از نمونه‌هایی با غلظت پاتوژن یا DNA/RNA کم (مانند مایع مغزی نخاعی) را مورد پژوهش قرار می‌دهید، توصیه می‌شود از poly(A)-homopolymers به‌عنوان اسید نوکلئیک حامل استفاده کنید.

توجه داشته باشید که برخی از کیت‌های استخراج، به‌عنوان‌مثال کیت استخراج RNA ویروسی QIAamp، از قبل حاوی RNA حامل (مکمل بافر لیز کننده) است. در این موارد، افزودن حامل پلی (A) نیاز نیست.

حرف آخر تفاوت کیت های استخراج دستی و دستگاهی

استخراج دستی اسید نوکلئیک: روشی زمان بر و خطاپذیر
بسیاری از استخراج‌های دستی به استفاده از ترکیبات شیمیایی متعدد وابسته هستند. این امر سبب می‌شود که فرایند استخراج هم زمان بر شود و هم نیاز به دخالت انسان برای هر مرحله دارد. ازاین‌رو احتمال آلودگی نمونه بالاست.

روش کلی استخراج دستی شامل چهار جزء است:

  1. لیز سلولی برای شکست دیواره سلولی یا بافت‌ها
  2. دناتوره کردن کمپلکس‌های نوکلئوپروتئینی
  3. غیرفعال‌سازی نوکلئازهای RNA/DNA
  4. اجتناب از آلودگی

به‌عنوان بخش جدایی‌ناپذیر از تحقیقات بالینی، استخراج باید ساده شود. این منجر به توسعه روش‌های مدرن تخلیص اسید نوکلئیک فاز جامد شد که سبب اختراع کیت‌های استخراج ستونی و برداشته شدن اولین گام به سمت اتوماسیون استخراج گردید. تخلیص ستونی منجر به ایجاد پروتکل‌های سریع‌تر استخراج شد که شامل 4 مرحله اصلی است:

  1. لیز سلولی برای شکست دیواره سلولی یا بافت‌ها
  2. جذب اسید نوکلئیک
  3. شستشو با اجتناب از آلودگی
  4. اِلوشن

در این روش نیمه‌خودکار از مواد مختلفی برای تصفیه اسید نوکلئیک استفاده می‌شود. اما پای ثابت این روش، استفاده از ماتریس سیلیس برای تبادل آنیونی می‌باشد. 

ازآنجایی‌که فناوری و تقاضا هر دو روند صعودی دارند، آشکار می‌شود که اتوماسیون در آزمایشگاه‌ها گام بعدی در تحقیقات بیوتکنیکی است. ازاین‌رو سیستم‌های استخراج خودکار طراحی شده‌اند که به ساده‌سازی و افزایش خروجی استخراج اسید نوکلئیک کمک می‌کنند. ماشین‌های خودکار نه‌تنها زمان کار و هزینه‌های نیروی کار موردنیاز را کاهش می‌دهند، بلکه باعث افزایش ایمنی، کیفیت و بازده می‌شوند.

برای رقابت با استخراج دستی، سیستم‌های خودکار باید چندین الزام را برآورده کنند، مانند نتایج قابل تکرار، حداقل آلودگی، سهولت استفاده، کاهش مداخله دستی انسان و خروجی باکیفیت بالا برای آزمایش‌های پایین‌دستی.

سه مرحله اصلی در استفاده از یک سیستم خودکار وجود دارد:

  1. معرف‌ها را به نمونه‌های محلول اضافه می‌کنند.
  2. کارتریج مناسب کیت را در دستگاه قرار می‌دهند.
  3. دکمه شروع را می‌زنند و تمام.

در روش دستگاهی می‌توان از همان کیت‌های مورداستفاده در استخراج اسید نوکلئیک فاز جامد استفاده کرد. این امر سبب می‌شود زمان لازم برای تکمیل فرایند به‌شدت کاهش یابد. اما اصلاً در ایران این روش‌ها یافت می‌شود؟

جواب مثبت است. به نقل از خبرگزاری فارس، محققان ایرانی شرکت آرینا زیست در سال 1400 موفق به تولید دستگاه تمام اتوماتیک استخراج اسید نوکلئیک شدند. استخراج 12 نمونه به طور هم‌زمان و قیمت بسیار پایین نسبت به نمونه مشابه خارجی از جمله ویژگی‌های این دستگاه تمام ایرانی است.

منابع

qiagen.com/it/resources/faq?id=1b827863-0ce4-4ee4-92e0-219b92c2eb60&lang=en

biocompare.com/Nucleic-Acid-Purification/9977-Automated-DNA-Extraction-Systems

biocompare.com/Nucleic-Acid-Purification/25857-Plasmid-DNA-Purification-Kits

info.gbiosciences.com/blog/plasmid-isolation-overcoming-the-challenges-for-isolating-plasmid-dna

biocompare.com/Cloning-and-Expression/7085-Magnetic-Bead-DNA-Isolation

youth4work.com/Talent/DNA-Extraction/Forum

pgc.up.edu.ph/services/dna-extraction

sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0003267009004450

fna.ir/32lpb

biochain.com/blog/automated-dna-extraction-systems-vs-manual-methods-how-automatic-extraction-instruments-are-changing-research

مطالب مرتبط

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.