تست الایزا را در حالت معمول برای ردیابی آنتی ژن یا آنتی بادی بكار می برند بدین ترتیب كه یكی از این دو ماده در بستر جامد ثابت می شود و برای ردیابی دومی بكار گرفته می شود اما اساسا برای ردیابی هر جفت ماده ای كه مثل جفت آنتی ژن و آنتی بادی به […]
آزمون اویدیتی الایزا
با توجه به نقش مهم کیفیت آنتی بادی ها در بسیاری از تست های دارویی و ایمونولوژیکی، شاخص اویدیتی که به عنوان توانایی اتصال آنتی ژن به آنتی بادی تعیین می شود، شاخص خوبی برای استعداد آنتی بادی در برقراری اتصال قوی با آنتی ژن خواهد بود. سنجش اویدیتی آنتی بادی IgG و زیر کلاسهای آن توضیح داده می شود.
به طور خلاصه، دو پلیت با غلظت بهینه از آنتی ژن در هر چاهک کوت خواهد شد و تمام مراحل کار طبق پروتوکل الایزا (ذکر شده در ادامه) انجام خواهد شد. الایزا در دو پلیت بطور همزمان انجام می شود و در زمان شستشوی پس از انکوباسیون سرم، یکی از پلیت ها سه بار با PBS-T شستشو می شود. وپلیت دوم با محلول اوره شستشو می شود. پس از آن ، دوپلیت با آنتی بادی ثانویه انکوبه شده و با افزودن سوبسترا واکنش آنزیمی انجام خواهد شد. اوره قادر به جدایی اتصالات ضعیف آنتی بادی-آنتی ژن می باشد.
بنابراین بر اساس این آزمون، آنتی بادی های با اویدیتی بالا که اتصال مجکمی با آنتی ژن برقرار می کنند به راحتی از آنتی ژن جدا نمی شوند. در انتها پس از رسم منحنی، با تقسیم سطح زیر منحنی در زمان تیمار با اوره به سطح زیر منحنی در زمان بدون تیمار با اوره (شرایط معمولی)، اویدیتی آنتی بادیها به دست خواهد آمد.
محلول های مورد نیاز :
- بافر کوتینگ
- بافر شستشو
- بافر بلاکینگ
- بافر incubation
روش کار: آزمون اویدیتی الایزا
- تهیه غلظت مناسب از آنتی ژنمورد نظر با استفاده از بافر coating و افزودن آنتی ژن به میزان 100 میکرولیتر در هر چاهک. (در دو پلیت جداگانه و کاملا با شرایط یکسان) و نگهداری در دمای 4 درجه به مدت 16 ساعت.
- شستشو با 200 میکرولیتر بافر شستشو سه بار به مدت 5 دقیقه و خشک کردن کامل چاهک ها.
- 100 میکرولیتر بافر بلاکینگ به چاهک های مورد نظر اضافه شده و برای 1 ساعت در دمای آزمایشگاه انکوبه شوند.
- پس از طی مدت انکوباسیون و سه بار شستشوی چاهک ها به مدت 5 دقیقه، سرم یا آنتی بادی اولیه با رقت مناسب در بافر incubation تهیه شده و به هر چاهک 100 میکرولیتر اضافه شود و برای 90 دقیقه در دمای آزمایشگاه انکوبه شود.
- پس از طی مدت انکوباسیون، پلیت شماره 1 با استفاده از بافر شستشوی. حاوی PBS-T سه بار و هربار به مدت 5 دقیقه شستشو داده شود. و پلیت شماره 2 با استفاده از محلول اوره سه بار و هربار به مدت 5 دقیقه شستشو داده شود.
- آنتی بادی ثانویه برای شناسایی هر کدام از زیر کلاس های IgG باتوجه به دستورالعمل ذکر شده. توسط شرکت سازنده در بافر Incubation تهیه شود. و به چاهک ها به حجم 100 میکرولیتر اضافه شود و برای 90 دقیقه در دمای آزمایشگاه انکوبه گردد.
- پس از طی مدت انکوباسیون و سه بار شستشوی چاهک ها به مدت 5 دقیقه،آنتی بادی ثانویه anti-mouse IgG antibody peroxidase با رقت مشخص شده توسط شرکت سازنده. به چاهک ها به مقدار 100 میکرولیتر اضافه شد و برای 90 دقیقه در دمای آزمایشگاه انکوبه شد.
- پس از سه بار شستشوی چاهک ها به مدت 5 دقیقه، به هر چاهک به مقدار 100 میکرولیتر سوبسترای TMB (Tetramethylbenzidine) به عنوان سوبسترای آنزیم پراکسیداز برای شناسایی آنتی بادی های ثانویه متصل مانده به ترکیب آنتی بادی اول و آنتی ژن اضافه شود که واکنش رنگی حاصل با H2SO4 2 نرمال متوقف خواهد شد ودر طول موج 450 نانومتر، OD چاهک ها اندازه گیری شود.
مطالب مرتبط
برچسب ها:
مطالب مرتبط
Share It