اختراع واکنش زنجیره ای پلیمراز) PCR( نقطه عطفی در تاریخ علوم زیســتی و پزشکی است. کاربرد PCR نه تنها به طور کامل در زمینه تحقیقات ژنتیک مولکولی به خصوص در بیوتکنولوژی جانوری و گیاهی انقلابی ایجاد کرده است بلکه این تکنیــک، ارتباط و کارایی مبتکرانه خود را در زمینه های دیگر علم پزشکی قانونی، سیستماتیک مولکولی، اپیدمیولوژی مولکولی، باستان شناسی، مردم شناسی، ژنتیک تکاملی و غیره نیز ثابت کرده است .PCR سنتی منجر به ظهور ،RT-PCR qPCR و ترکیب RT-PCR/qPCR شده است. همچنین PCR قادر اســت با موفقیت «پروژه ژنوم انسان» را از طریق توانایــی تکثیر و توالی یابی ژن های انســان، تکمیل کند که بیشــتر پایه و اساس مهندسی ژنتیک شــده است و حتی در حال حاضــر ایجاد تغییرات مفید در ژنوم یک ارگانیســم را امکان پذیر ســاخته است. واریانت های PCR در بسیاری از پیشــرفت های اخیر که علوم دوره مدرن را ایجاد کرده اند به طور موفقیت آمیزی مورد استفاده واقع شده است.
هدف از بكارگيري اين روش توليد DNAتك رشته اي است. ترجیحا برای تکثیر یکی از رشــته های مولکول DNA هدف با اســتفاده از غلظــت نابرابر پرایمر به کاربرده می شــود به طوریکه چنین همانند ســازی از روی علم ریاضیات با استفاده از پرایمر مازاد رخ می دهد.
در اين روش يكي از پرايمرها به تعداد كمتر و پرايمر ديگر به تعداد بيشتر با اختلاف 1:50 یا 1:100 به محيط واكنش اضافه مي شود. در حدود 20 چرخه ابتداييPCR محصول دو رشته اي به صورت فاز نمايي توليد مي گردد اما پس از 20 چرخه كه غلظت پرايمر كمتر در واكنش قابل چشم پوشي است وبه عبارت عاميانه تر به دليل تمام شدن پرايمر با غلظت كمتر در چرخه هاي بعدي PCR فقط يك رشته از الگو به صورت خطي تكثير مي شود.پس از پايان PCRچند نسخه DNA دو رشته اي و تعداد زيادي DNA تك رشته اي از ژن مورد نظر ايجاد خواهد شد
روش Amplification Refractory Mutation System اين روش تحت عنوان تكثير اختصاصي اللها با PCR نيز ناميده ميشود.اين روش براي تشخيص موتاسيون هاي نقطه اي به كار مي رودوجهت تشخيص اللهاي طبيعي و جهش يافته طراحي شده است.اين روش بر پايه تفاوت نوكلئوتيد انتهاي 3َ پرايمرهايي است كه براي اللهاي مختلف طراحي شده است دو واكنش PCR با استفاده از يك DNA الگودر2 لوله جداگانه انجام مي شود كه يكي از آنها حاوي پرايمرهاي جهش يافته و ديگري حاوي پرايمر طبيعي مي باشد در هرواكنش پرايمر مشترك به همراه يكي از 2 پرايمراختصاصي الل مورد استفاده قرارميگيرد.حالت اختصاصي پرايمرهابراي هريك ازاللها ناشي از نوكلئوتيد انتهاي 3َ آنهاست كه با هم متفاوت بوده.چنانچه پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر طبيعي انجام شود نشان دهنده نبود جهش نقطه اي در باز مورد نظراست واگر پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر جهش يافته انجام شود نشان دهنده حضور جهش نقطه اي در باز مورد نظر است.نكته مهم اين است كه از DNAپليمرازي كه فاقد خاصيت تصحيح كنندگي اگزونوكلئازي َ5َ à 3َ است،استفاده شودزيرا استفاده از يك آنزيم اصلاحگر باعث برداشتن باز جفت نشده انتهاي 3َ ميگردد و در واقع توانايي متمايز كردن دو الل از بين ميرود. از اين روش در تشخيص موتاسيون هاي مولد مقاومت دارويي در باكتري ها استفاده مي شود.
زمانيكه بهترين شرايط اتصال فراهم شود باندهاي غير اختصاصي ممكن است قبل از انجام اولين چرخه PCR ايجاد شودحتي تاوقتيكه دماي لوله ها تا°C70-°C65 افزايش مي يابد اتصالات غير اختصاصي پرايمر/پرايمر و پرايمر/ الگوممكن است بوجود آيد و بعنوان سوبستراي اوليه براي DNAپليمراز عمل كند.ساده ترين روش براي جلوگيري ازچنين اتصالات اوليه غيراختصاصي وبهتركردن شرايط اتصال صحيح پرايمر،استفاده از روش Hot start است كه اساس اين روش بر جدا كردن فيزيكي مواد واكنش تا زمان رسيدن به دماي بالا مي باشد.يك يا چندماده قبل از رسيدن به دماي بالاتر از °C70 از واكنش جدا مي شود و پس از رسيدن به دماي بالا در واكنش وارد مي كنند.ارزان ترين روش اضافه كردن تمامي مواد واكنش به جز DNA پليمراز است.اين روش براي تعداد زياد نمونه ها به دلايل زيرامكان پذير نيست:1-زمان مورد نياز براي اضافه كردن آنزيم به هرلوله زياد است.2-اشتباه هاي ناشي از عدم تمركز حواس كه باعث اضافه نكردن آنزيم به يك يا چند لوله ميشود .3 -احتمال آلودگي لوله ها به دليل باز شدن در آنها. براي حل اين مشكل وتسهيل انجام PCRگرم آغاز يك سري محصولات تجاري عرضه شده است.مثل Ampliwax Gemsكه گلوله هاي مومي با فرمول خاص ميباشند. يك عدداز آن را در لوله هاي حاوي پرايمر،dNTPs(دئوكسي نوكلئوتيد تري فسفات)،Mg++ اضافه كرده و واكنش در يك ترموسايكلر در دماي °C80-°C75 به مدت 10-5 دقيقه نگهداري ميشود تا موم ذوب شود سپس لوله ها تا زير°C35 سرد ميشودتا موم مجددا جامد شودو يك لايه محافظ بر روي مواداوليه واكنش تشكيل شود.موادديگر واكنش از قبيل DNAالگو،DNAپليمراز و بافر را ميتوان بر روي لايه موم ريخت و سپس PCR را آغاز كرد.در هنگام بالا رفتن دما موم ذوب ميشود و مواد جامد موجود در لايه رويي موم با مواد پايين مخلوط ميشوند تا PCRآغاز شود و موم به روي فاز آبي قرار ميگيردلايه موم هم يك سددر برابرتبخيرآب درحين چرخه هاي دمايي است وهم بصورت يك مانع فيزيكي،براي جلوگيري از آلودگي عمل ميكند
الگوي اوليه دراين روش مولكول RNA تك زنجيره اي است.ازآنجائيكه DNA پليمراز قادربه استفاده ازRNAبعنوان الگو نميباشد،مرحله ديگري به PCR اضافه شده است.طي اين مرحله با استفاده از آنزيم RT(Reverse Transcriptase) از الگويRNA ،مكملش يعني cDNA سنتز ميشودوسپس بوسيله تكنيك PCRتكثير مي يابدآنزيم نسخه بردار معكوس دراين روش ازويروس ميلوبلاستوماي مرغ (AMV) بدست مي آيد.كاربرد اين آنزيم به دليل حساس بودنش به حرارت پايين بوده ولي با كشف باكتري به نام ترموس ترموفيلوس اين روش بهبود يافت.اين باكتري DNA پليمراز مقاوم به حرارت به نام Tthتوليد مي كندو در حضور يون منگنز داراي فعاليت نسخه برداري معكوس است و در دماي°C72 توسط اين آنزيم از روي RNA، DNA ساخته ميشود.سپس منگنز اضافي توسط اتيلن گليكول تترااستيك اسيد EGTA حذف ميشودواين آنزيم ازDNA اي كه خود ساخته استفاده و آن را تكثير مي كند.براي تكثير ماده ژنتيكي ويروس هاي RNAدار مثل HIV از اين روش استفاده ميشود.
روش Randomly amplification polymorfic DNA تحت عنوان PCR با پرايمرهاي متزلزل Arbitrarily primed PCR نيز ناميده مي شود.يك روش سريع برای انگشت نگاري ژنومي مي باشدو انگشت نگاري ژنومي در تحقيقات جنايي،جرم شناسي،پزشكي قانوني ذرتعيين والدين وروابط پدر فرزندي وتعيين روابط خويشاوندي نقش تعيين كننده دارد.دراين روش تنها از يك پرايمر چند نوكلئوئيدی كوتاه(10-9نوكلئوئيدي محتوي 50%GC )كه بطور تصادفي از توالي هاي بازي انتخاب شده است برای ساخت DNA از روي ناحيه اي از DNAالگو كه پرايمر تا حدي متصل مي شود،استفاده ميشود.RAPD-PCR براسا س تكثير تصادفي در دماي پايين انجام مي شود،نواحي مختلف ژنومي به طوهمزمان در يك واكنش PCR قابل تكثير مي باشد. چرخه هاي ابتدايی بايد دردمای پايين°C50- °C37 معمولا براي 5 چرخه اوليه انجام شود تا پرايمر به جايگاه هاي تصادفي در داخل ژنوم متصل شوند.پسس دما افزايش مي يابد (°C55)،واكنش براي 35-30 چرخه ديگر ادامه مي يابد،در واقع تنها جايگاه هاي مناسب تر از بين جايگاه هاي تصادفي اوليه تكثيرخواهند شد.البته اگر مكان هاي اتصال پرايمر روي دو رشته الگو در فاصله مناسبي قرار گرفته باشند، و جهت گيري مناسبي نيز نسبت به هم داشته باشند،DNA پليمراز قادر به طي كردن فاصله بين 2 پرايمر اتصال يافته خواهد بود.با بهينه سازي دقيق مي توان در حدود 50 تا 100 قطعه DNA مختلف بدست آورد.اين چند شكلي هاي DNAيا از اختلافات موجود در توالي DNAدر مكانهاي اتصال پرايمر يا از دگرگوني هايي كه در اثر اضافه شدن،حذف و واژگوني در نواحي تكثير شده روي داده است،منشاء ميگيرد.باندهاي مشاهده شده بازتابي ازساختمان كل مولكول DNAاستفاده شده به عنوان الگو مي باشند.اين روش تكنيكي عالي درفيلوژنتيك ياشجره شناسي ميباشد، انتظارميرودكه دو موجود زنده خويشاوند داراي الگوي باندي مشابه تري نسبت به2 موجودي باشندكه از نظرتكاملي دورتر هستند.
راه حلي براي افزايش حساسيت ودقتPCR است وجداسازي محصول اختصاصي مورد نظر را از بين انبوه محصولات غير اختصاصي ميسر مي سازد .دراين روش ازدوجفت پرايمراستفاده مي شودطوريكه جفت دوم دربين جفت اول جاي مي گيردابتدا پرايمراول(پرايمربيروني) اضافه مي شود و باعث تكثير قطعاتي از DNA مي شودكه احتمالا تعدادي از آنها محصولات غيراختصاصي اند. محصول PCR واكنش اول به عنوان DNA الگو براي PCR دوم در حضور پرايمرهاي داخلي(پرايمردوم) كه مكمل قسمت داخلي تر قطعه DNAموردنظر است مورد استفاده قرار ميگيرد.احتمال بسيارضعيفي وجوددارد كه محصولات غيراختصاصي براي جفت پرايمرداخلي اختصاصي ديگرنيزداراي محل شناسايي باشند نتيجاَ اين امرباعث افزايش نسبت محصول واقعي به محصول غيراختصاصي خواهدشداگر طراحي 2پرايمر داخلي به دليل عدم دسترسي به توالي كامل ممكن نباشد مي توان با استفاده از توالي پرايمر اوليه با افزودن 2 يا 3 نوكلئوتيد به انتهاي 3َ پرايمردوم راطراحي كرد بااينكه پرايمرهاي داخلي همپوشاني قابل توجهي باپرايمرهاي اوليه دارداما باعث تكثيراختصاصي توالي هدف وحذف محصولات غيراختصاصي ميشود.البته در اين حالت نبايد از آنزيمهاي داراي فعاليت تصحيح خطا 3َاگزونوكلئازي استفاده كرد تا انتهاي 3َتعين كننده حفظ شود.
دراين روش هدف تكثير قطعه اي ازDNAاست كه هيچ اطلاعي در مورد توالي پايانه هاي آن در دست نيست ولي در عوض توالي قسمتي از يك ناحيه دروني آن در دست است.براي اين هدف DNAژنومي با يك آنزيم محدودالاثرمناسب هضم ميشودوسپس اتصال مجدد
مولكولها جهت بدست آوردن قطعات DNAحلقوي.بعد از حلقوي شدن توالي هدف شناخته شده با يك آنزيم محدودالاثرديگرهضم ميشودكه اين امر باعث قرارگيري نواحي ناشناخته بين 2ناحيه شناخته شده حاصل از هضم آنزيمي ميشود.حال باطراحي پرايمرمناسب براي توالي شناخته شده ميتوان نواحي ناشناخته راتكثيركرد.اين روش براي شناسايي جايگاه هاي الحاق ويروسها و ترانسپوزونهايي كه بطور تصادفي در ژنوم ادغام ميشود مفيد است.
دراين تكنيك ازچندين جفت پرايمراختصاصي دريك محلول PCR جهت تكثير چندين توالي هدف در يك زمان استفاده مي شودبنابرين مي توان با آزمايشات كمترو زمان كوتاه تراطلاعات بيشتري جمع آوري كرد.انواع :Multiplex PCR1- واكنش PCR با يك الگو:كه دراين روش يكDNA الگودر طولش با چندين جفت پرايمر جهت تكثير نواحي مخصوص جفت ميشود.با توجه به اينكه محصولات بدست آمده اندازه متفاوت دارندبخشهاي بزرگي از يك DNA هدف جهت جستجوي تغييرات مي توان بررسي شود.2-واكنش PCR با چند الگو: در ميكروب شناسي باليني با استفاده ازاين روشدر عفونتهاي مخلوط امكان شناسايي چندين عامل بيماري در يك نمونه بطورهمزمان وجوددارد.باپرايمرهاي مختلف و ويژه به جستجوي عوامل مختلف پرداخته ميشود پي به منشاء عفونت ميبرند.چونكه دراين تكنيكهاازچندين پرايمراستفاده ميشودرعايت نكات زيرضروري است:1- بايدپرايمرهارا به گونه اي طراحي كردكهTmدماي ذوب يكساني داشته باشندو يااختلاف دماي ذوب پرايمرها بيش از °C5-°C3نباشد.2- اختصاصيت پرايمرهاي طراحي شده براي توالي هدف مهم است3-پرايمرهاي طراحي شده بايد براي تشكيل دايمرپرايم با همه پرايمرهاي حاضر در مخلوط واكنش بررسي شود.چون ديمر شدن منجر به تكثير محصولات غير اختصاصي ميشود.
در اين سيستم تشخيصي يك ماده فلورسانت در طي واكنش متناسب با ميزان محصولات هرسيكل آزادميشودوميزان فلورسانت آن توسط دتكتورشناسايي وثبت ميگرددوبدين ترتيب ميزان DNAتكثير شده طي يك چرخه تا چرخه بعدي را ميتوان اندازه گيري كرد.بنابراين ميزان محصول در هرچرخه قابل رديابي است در حاليكه محصول روشهاي سنتي پس از پايان واكنش و الكتروفورز مشخص ميشود.
روشهاي سنجش با Real time PCR:1- استفاده از رنگهاي فلورسنت مثل سايبرگرين:همزمان با دورشته اي شدن DNAسايبرگرين به شياركوچك DNAمتصل ميشودوبا جذب طول موج498نانومتري، نور522 نانومتري را ساطع ميكند.با افزايش مقدار محصول PCRرنگ بيشتري متصل ميشودو ميزان فلورسانس افزايش مي يابد ،پس ميزان فلورسانس متناسب با مقدار DNA دورشته اي در واكنش است اما مهمترين عيب آن اتصال به دو رشته هايي مثل پرايمردايمر و ديگر باندهاي غيراختصاصي است كه باعث مي شود نتايج بيشتر از غلظت اصلي برآورد شود. 2- استفاده از پروبهاي فلورسنت:پروبها برخلاف سايبرگرين براساس تشخيص اختصاصي توالي محصول كار ميكنند.پروبها معمولا يك رنگ فلورسنس زا درانتهاي َ5(Reporter) و يك رنگ خاموش كننده درانتهاي 3َ ( (Quencherدارندو وقتي در فاصله مولكولي نزديكي قرار دارند بازتابشي در دستگاه ثبت نميشود اما پس از جدايي نور ساطع شده از Reporter توسط Quencher قابل جذب نيست و توسط دستگاه بصوذت فلورسانس قابل اندازه گيري است.مثلا استفاده ازپروب Taq Man كه اساس آن اگزونوكلئازي DNA پليمراز Taqاست.يك پروب 30-20 نوكلئوتيدي كه در انتهاي 5َ به يك رنگ فلورسانس متصل است و در انتهاي 3َ به يك عامل خاموش كننده. پروب حدود چندباز بعداز انتهاي 3َيكي ازپرايمرها طراحي ميشودآنزيم پس از نزديك شدن به پروب با استفاده از فعاليت َ3 à 5َاگزونوكلئازي خود پروب را ليز ميكند و در نتيجه رنگ فلورسانس از عامل خاموش كننده جدا ميشود و باعث ايجاد فلورسانس ميگردد.
Share It