انتخاب روش کلونینگ

شما روزها و هفته ها به فکر یک پروژه شگفت انگیز هستید. شما پروتکل های خود را نوشته اید، آزمایش های خود را طراحی کرده اید و معرف های خود را آماده کرده اید و می خواهید بهترین چیزها را مهندسی کنید. شما آماده کلون کردن هستید!

اما … چطور؟

کلونینگ دیگر محدود به آنزیم های محدود کننده نیست – اگرچه هنوز بسیاری از آزمایشگاه ها عاشق استفاده از آنها هستند! با وجود بسیاری از فن آوری های موجود در حال حاضر، اکنون شما با این چالش روبرو هستید که می توانید بفهمید کدام سیستم ممکن است برای اهداف خاص شما به بهترین وجه کار کند.

چهار عامل مهم که برای هر آزمایش باید در نظر بگیرید:

سرعت
هزینه
دشواری

۴- کارآیی

۵- تعداد درج… که برای کلونینگ به طور خاص، این نکته بسیارمهم است

از آنجا که برخی از روشها برای ترکیب چند DNA نسبت به سایرین قابل استفاده هستند.

انتخاب روش کلونینگ

در پست امروز ما به مقایسه سطح بالایی از روشهای محبوب کلونینگ با تأکید ویژه بر این پنج دسته می پردازیم. لطفاً توجه داشته باشید که بسیاری از روشهای کلونینگ زیر به طور گسترده در سایر مقالات شرح داده شده اند. بنابراین اگر شما علاقه مند به کسب اطلاعات بیشتر در مورد هر یک از آنها هستید ، لطفاً روی پیوندها در طول متن کلیک کنید یا بخش “لینک های مفید” را در انتهای پست مشاهده کنید!

سرعت:

مهلت گرنت شما نزدیک به اتمام است یا استاد مشاور شما در خواست نتایج داشته است. اگر عجله دارید، کلونینگ گلدن گیت ممکن است برای شما مناسب باشد. این روش به آنزیمهای محدود کننده چندکاره تیپ IIS تکیه دارد. که با ایجاد برش در خارج از سایت های تشخیصی خود به شما امکان می دهند به راحتی اورهنگ های سفارشی ایجاد کنید تا حداکثر ۶ قطعه مختلف را با ترتیب مقرر آماده کنید. این قطعات را می توان در یک لوله جمع کرد و در حدود ۳۰ دقیقه لایگیت کرد!

از طرف دیگر، ممکن است کلونینگ Gibson را در نظر بگیرید. در این تکنیک ، شما ابتدا یک دور از PCR را انجام می دهید تا قطعات DNA با ۱۵-۴۰ جفت باز همولولوژی در انتهای آنها تولید شود. این قطعات سپس با یک اگزونوکلئاز، یک پلیمراز و یک DNA لیگاز ترکیب می شوند تا یکسری از اتصالات در یک ساعت یا کمتر را انجام دهند. این اتصالات قطعات را به ترتیب تعیین شده توسط همسانی آنها ترکیب می کند.

همچنین ممکن است FastCloning را که ابتدا توسط Chaokun Li و همکاران شرح داده شده است ، در نظر بگیرید. در اینجا شما به سادگی با PCR وکتور وinsert خود را تکثیر می کنید ، DpnI قالب ها را هضم می کند ، و محصولات PCR را به E. coli منتقل می کند. لیگازهای داخل E. coli سپس محصولات PCR را از طریق اورهنگ های ایجاد شده در PCR (مکانیسم دقیق به خوبی درک نشده) ترکیب می کنند.

سرانجام ، کلونینگ TOPO گزینه خوب دیگری است وقتیکه زمان بسیار مهم است. این روش نیاز به چارچوب وکتوری حاوی یک سایت برش توپوایزومراز I ، توپوایزومراز I و یک درج تولید شده توسط taqپلیمراز است. هنگامی که مخلوط شدند، توپوایزومراز I عملکرد اندونوکلئاز و لیگاز را در حالی که ۵ ‘آدنوزین اضافه شده توسط Taq با توپوایزومرازI تولید کننده اورهنگ در وکتور فراهم می کند. پس از ترکیب ، مراحل برش و بستن در عرض چند دقیقه اتفاق می افتد.

هزینه:

بودجه معمولاً محدود است – در صورت تخصیص بودجه ، از چه روش کلونینگ باید استفاده کنید؟ بیشتر فرآیندهای کلونینگ به یک یا دو واکنش PCR برای تولید الگو برای فرآیند کلونینگ نیاز است. زمان صرف شده برای انجام آزمایشات نیز به طور کلی قابل مقایسه است بنابراین بهترین راه برای مقایسه هزینه ها، بررسی قیمت آنزیم های اضافی مورد نیاز است.

FastCloning ممکن است ارزانترین قیمت در تمام گزینه های مورد بحث باشد زیرا تنها به PCR و آنزیم DpnI ارزان قیمت نیاز دارد. و شما به E. coli اجازه می دهید تا کار را برای شما انجام دهد. کلونینگ مبتنی بر آنزیم و لیگاز سنتی یک روش نسبتاً ارزان برای انجام کار است، مشروط بر اینکه قبلاً آنزیمهای مناسبی را در اطراف آزمایشگاه داشته باشید. اگر اینگونه نباشد، به ازای هر آنزیم در حدود ۵۰ تا ۶۰ دلار نیاز خواهد بود. با این وجود ، پس از دریافت چند مورد از آنزیمهای رایج، هزینه واکنش کلونینگ به طرز چشمگیری کاهش می یابد، زیرا یک لوله آنزیم برای حداقل ۵۰ واکنش کلونینگ کافی است. هزینه لیگاز با آنزیم های محدود کننده قابل مقایسه است و در کل برای کلونینگ سنتی به دنبال چند دلار در هر واکنش هستید.

Sequence and Ligation Independent Cloning (SLIC) همچنین می تواند یک انتخاب عالی باشد، زیرا پلیمراز T4 مورد نیاز برای این روش نسبتاً ارزان است و می تواند در حدود ۷۰ دلار بدست آورد، در نتیجه قیمت چند دلار برای هر واکنش. در مقایسه، اگر یک مخلوط از پیش ساخته خریداری کنید، مونتاژ گیبسون می تواند بیش از ۱۵دلار در هر واکنش هزینه شود. با این وجود، مونتاژ گیبسون روشی بسیار متنوع و کارآمد برای تولید طیف گسترده ای از سازه ها است. به طور مشابه ، کلونینگGateway می تواند به ترتیب ۲۰ تا ۳۰ دلار در هر واکنش اجرا شود اما می تواند برای تولید سریع کلون های مختلف مورد استفاده قرار گیرد.

دشواری:

اگر یک کلونر باتجربه هستید، احتمالاً با انتخاب آنزیم های مناسب، بهینه سازی غلظت معرف یا ایجاد خالص سازی قطعات DNA از ژل ها، مرعوب نمی شوید. اگردر بازی کلونینگ نسبتاً جدید هستید، یا به دنبال یک رویکرد ساده تر هستید، ممکن است بخواهید Gateway را امتحان کنید. این روش ، توسعه یافته توسط Invitrogen و مبتنی برادغام توالی های فاژ لامبدا، به واکنشهای نوترکیبی اختصاصی جایگاه، که توسط مخلوط های آنزیم BP Clonase و LR Clonase کاتالیز شده است، متکی است. پس از تولید درج مناسب توسط PCR ، دیگر نیازی به هضم محدودکننده، تصفیه ژل یا لایگیشن وجود ندارد. پروتکل کلونینگ کلی Gateway نسبتاً انعطاف پذیر و سازگار با کلون کردن انواع مختلف DNA مانند cDNA، قطعات PCR یا DNA ژنومی است. همچنین به یاد داشته باشید که کیت های کلونینگ تجاری در دسترس اغلب می توانند روند کار را بسیار ساده تر انجام دهند، زیرا آنها با پروتکل های جامع و آزمایش شده و همچنین معرفهای از پیش تعیین شده و آماده استفاده خواهند شد. شرکت های علمی Thermo Fisher ، Origene و NEB® همه مکان های خوبی برای جستجوی کیت های مفید هستند!

کارایی:

اگر بتوان بعد از این همه سخت کوشی در رابطه با کلونینگ ، حداقل یک نتیجه موفق را تضمین کنید خوب نخواهد بود؟ در حالی که هیچ تضمینی وجود ندارد، برخی از تکنیک های کلونینگ مقیاس را به نفع شما قرار می دهند. برای مبتدیان، کلونینگ Golden Gate به دلیل استفاده از آنزیم های محدود کننده همه کاره بسیار کارآمد است. در کلونینگ Golden Gate ، سازه انتهایی مورد نظر شامل جایگاه شناسایی نوع IIS نمی باشد و به شما امکان می دهد آنزیم های نوع IIS را در واکنش به هضم وکتورهای متصل شده جدید و سایر محصولات نادرست نگه دارید. این ویژگی واکنش را به نفع مونتاژ مورد نظر سوق می دهد تا فرآیند نزدیک به ۱۰۰٪ کارآمد شود. کلونینگ Gateway همچنین شانس موفقیت بسیار بالایی را نشان می دهد (> 95٪ برای یک درج واحد) ، بیشتر به دلیل استفاده از ccdB سمی برای جلوگیری از ایجاد هر وکتور غیر نوترکیب. روش های مستقل از بستن مانند Gibson و SLIC نیز بسیار کارآمد هستند. اگرچه بازده با افزایش تعداد قطعات مورد نظر شما کاهش می یابد.

تعداد insert متعدد:

برخی از روش های کلونینگ وجود دارد که کار با insert های متعدد را بسیار آسان می کند. در میان آنها برخی از روشهای مبتنی بر homology، مانند Gibsonیا SLIC وجود دارد ، زیرا فرد می تواند مؤلفه ها را جمع کند و سفارش نهایی خود را از طریق همسانی توالی تعریف کند. مونتاژ Golden Gate نیز به طور مشابه، اجازه می دهد تا به طور همزمان مجموعه ای از پیوندهای بدون مشکل را به دنبال هضم با آنزیم های محدود کننده نوع II تکمیل کنید. اگر تعداد درج زیادی برای مونتاژ دارید ، همه این گزینه ها می توانند گزینه های خوبی باشند. اگر شماره درج شما کمی کوچکتر است، بگذارید بگوییم ۴ یا کمتر، همچنین می توانید از Gateway استفاده کنید.

این لیست ادامه دارد …

در این پست ، ما بسیاری از محبوب ترین روش های کلونینگ موجود را مرور کرده ایم ، که امیدواریم نکاتی را برای پروژه بعدی تان به شما ارائه داده باشد. اما بخاطر داشته باشید که روش های کلونینگ دیگربسیاری نیز وجود دارد – از جمله بعضی از آنها فقط به PCR متکی هستند، و مجموعه ای از کیت های کلونینگ تجاری موجود است که می توان برای انجام این آزمایشات از بین آنها انتخاب کرد. در بیشتر موارد، بیش از یک پاسخ صحیح وجود خواهد داشت، بنابراین نترسید از رویکردهای متعدد و کاوش کنید تا دریابید که کدام یک برای شما بهتر است.

کلونینگ خوبی داشته باشید (وحتما سازه های تمام شده خود را در Addgene واریز کنید!)