الکتروفورز Laemelli SDS-PAGE

Laemmli SDS PAGE
الکتروفورز – برای جداسازی پروتئین با وزن مولکولی نسبی بالاتر از 10 KD استفاده می شود. پروتئین های بسیار کوچک (کمتر از 10 KD) به علت توانایی کم اتصال به SDS، از طریق ژل های گرادیان یا با استفاده از شرایط مختلف الکتروفورز مثل Tricine-SDS-page جداسازی می شوند.

الکتروفورز Laemelli SDS-PAGE برای جداسازی پروتئین با وزن مولکولی نسبی بالاتر از 10 KD استفاده می شود. پروتئین های بسیار کوچک (کمتر از 10 KD) به علت توانایی کم اتصال به SDS، از طریق ژل های گرادیان یا با استفاده از شرایط مختلف الکتروفورز مثل Tricine-SDS-page جداسازی می شوند.

  1. محلول ها را بر اساس جدول زیر تهیه کرده و شیشه های الکتروفورز را اماده می کنیم.
  2. Aps و TEMED محلول را بین دو شیشه تا 1 سانتی متر پایین تر ازشانه ریخته و روی آن متانول میریزیم.
  3. 5% را بین دو شیشه میریزیم.
  4. x به غلظت نهایی 1x تهیه شد و به‌آرامی ورتکس شد(بتا مرکاپتو اتانول احیاکننده پیوندهای دی سولفیدی بوده و به خطی شدن پروتئین حاوی سیستئین کمک می‌کند).
  5. °C 95درون بن­ماری قرار داده شد.
  6. RPM سانترفیوژ شد و رسوب باکتری تهیه گردید.
  7.  μl50 درون چاهک تزریق گردید.

جدول – مقادیر موردنیاز برای آماده کردن ژل SDS-PAGE

5%15%15%14%14%
6.65/79.36/5910/588/2313/2H2O
1.712/52011/618/61016Acrylamide mix(30%)
6/3106/3106/310Tris 1.5 M –PH=8.8
1.5Tris 1M-PH=6.8
0.10.250.40.250.40.250.4SDS 10%
0.10.250.40.250.40.250.4APS 10%
0.010/0100.0160/0100.0160/0100.016TEMED
10254025402540Total
مقدارمواد موردنیاز برای تهیه الکتروفورز بافر1x
3 grTris
14.4 grGlycine
1 grSDS
1 LddHH2O
مقدارمواد موردنیاز برای تهیه لودینگ بافر X5
250 mM(PH:6.8) Tris-HCL
10%SDS
50%Glycerol
0.5%Bromophenol-blue
25mMb-mercapto ethanol(2ME)
10mLTotal

روش رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلو

پس ازخارج کردن ژل از  دستگاه الکتروفورز درون محلول رنگ آمیزی گذاشته شد وبه مدت 45 دقیقه روی شیکر قرار گرفت. پس از اتمام رنگ آمیزی ژل با آب مقطر شسته شد مرحله رنگ بری طی دو مرحله 45 دقیقه ای با حجم 100 میلی لیتر رنگ بر روی شیکر انجام گرفت. پس از شفاف شدن زمینه ژل ، ژل با آب مقطر شسته و از ژل عکسبرداری شد.

مواد مورد نیازمحلول رنگ آمیزی ژلمحلول رنگ بری ژل
کوماسی بلو R25050 میلی گرم
متانول خالص45 میلی لیتر45 میلی لیتر
آب مقطر45 میلی لیتر45 میلی لیتر
اسید استیک (گلاسیال)10 میلی لیتر10 میلی لیتر
حجم نهایی100 میلی لیتر

100 میلی لیتر

 

لینک های مفید

 

برچسب ها:

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.