واکنش PCR: ده نکته که هیچ کس به شما نمی گوید- قسمت اول

آماده سازی واکنش PCR یکی از مهمترین مراحل تکثیر PCR است. DNA Taq پلیمراز، dNTPs ، بافر واکنش PCR ، آغازگر PCR و DNA الگو از ترکیبات مهم  PCR هستند. تهیه یک  PCR مناسب برای تکثیر موفق مهم است. نه تنها تکثیر بلکه تکثیر ویژه هدف برای  PCR ما است.
ما باندهای DNA ناخواسته و دیمر Primer را نمی خواهیم. دایمرهای آغازگر دشمن واکنش PCR هستند.

سه دسته از معرفهای PCR

• دسته ۱: مواد بسیار مهم: dNTPs ، آغازگر DNA الگو و Taq DNAپلیمراز
• دسته ۲: مواد اساسی مهم: بافر واکنش، MgCl2 ، DMSO و سایر تقویت کننده های PCR.
• دسته ۳: کمترین اهمیت: رنگ بارگذاری ژل و آب (برخی از مواد آماده استفاده مخلوط حاوی رنگ بارگذاری ژل در مستر میکس است که هیچ نقش مهمی در تکثیر ندارد).

بدون معرفهای دسته ۱ ، واکنش PCR نمی تواند رخ دهد. ما نمی توانیم DNA را تکثیر کنیم. با این حال ، ترکیبات فرعی که تقویت کننده PCR هستند به اندازه ترکیبات اصلی اهمیت ندارند.اما تقویت کننده ها برای تقویت الگوهای سخت مانند الگوی غنی از GC و الگوی طولانی DNA بسیار مهم هستند.
توجه: تکثیر DNA الگوی طولانی نیاز به نوع خاصی از تنظیم PCR به نام PCR با برد طولانی دارد (long-range PCR).

ترکیبات PCR طبقه ۳ از اهمیت کمتری برخوردار هستند و تأثیر قابل توجهی در روند تقویت ندارد. در اینجا در این مقاله ، ما در مورد ۱۰ راز صحبت خواهیم کرد که هیچ کس در مورد  PCR بی نقص به شما نمی گوید.

نکات کلیدی:

• استخراج مناسب DNA
• غلظت و اجزای یک مستر میکس
• انواع DNA پلیمراز
• طراحی پرایمر
• استفاده از بافر  PCR
• غلظت DNA الگو
• دمای annealing واکنش
• غلظت MgCl2
• چرخه PCR
• سایر کاربردها
• آماده سازی واکنش PCR
• خلاصه
• نتیجه

1. استخراج DNA مناسب:

تکثیر موفقیت آمیز PCR به نحوه استخراج DNA ما بستگی دارد. هیچ کس استخراج DNA را یک موضوع جدی نمی داند. اما مطمئن باشید اگر از DNA با کیفیت ۱٫۸ استفاده کنید، ۵۰ درصد کار برای  PCR تقریباً انجام می شود. ناخالصی های موجود در DNA در تکثیر به نام مهار کننده های PCR عمل می کنند. SDS ، فنل و پروتئین ها در بین آنها متداول است. اگر DNA شما به درستی استخراج نشود، مهم نیست واکنش خود را چگونه بهینه می کنید، PCR شما در معرض خطر خواهد بود. با این حال ، این امکان وجود دارد که هر بار DNA ما بخوبی استخراج نشود. اما قبل از استفاده در تکثیر، DNA را با استفاده از کیت تصفیه DNA پاک کنید. وگرنه DNA خود را دوباره استخراج کنید.

غلظت ایده آل DNA الگو: ۳۰ تا ۵۰ng (برای واکنش ۲۵ میکرولیتر)
خلوص DNA بین ۱٫۷۷ ۱٫۸۹ (نسبت ۲۶۰/۲۸۰)

برای جزئیات بیشتر ، در مورد استخراج DNA می توانید مقاله قبلی ما را بخوانید

2. غلظت و اجزای سازنده:

Taq DNA پلیمراز با ترکیب dNPT ها رشته DNA در حال رشد را تقویت می کند. این بدان معناست که ، “بدون dNTPs تکثیری نخواهیم داشت”. با این حال ، غلظت dNTPs بسیار مهم است، اگر غلظت خیلی زیاد باشد، احتمال تکثیر غیر اختصاصی افزایش می یابد. معرفها نیز هدر می روند. من همیشه ترجیح می دهم از ترکیب مستقلی که شامل تمام dNTP ها (dATP ، dGTP ، dCTP ، dTTP) به همراه رنگ بارگذاری ژل است استفاده کنم. مستر مخلوط آماده استفاده بهترین انتخاب است، در زمان آماده سازی واکنش PCR و همچنین در طول الکتروفورز ژل آگارز موجب صرفه جویی در زمان می شود.

با این حال ، اگر به اندازه کافی مشتاق هستید که این کار را خودتان انجام دهید، خوب است. از آنجا که ما می توانیم غلظت هر dNTP را مطابق نیاز خود بهینه کنیم. غلظت ایده آل هر dNTP در  PCR به صورت زیراست:

dATP:  ۲۰۰μM

dTTP: 200μM

dGTP: 200μM

dCTP: 200μM

غلظت کل dNTP ها در واکنش PCR باید ۸۰۰μM برای ۵۰μL باشد. برای واکنش ۲۵μL از ۴۰۰μM (هر dNTPs 50μM) در واکنش PCR استفاده کنید. امیدوارم نیازی به محاسبات نداشته باشید.

3. انواع DNA پلیمراز:

DNA پلیمراز یکی دیگر از مهمترین عناصر اصلی است. DNA پلیمراز در ساخت DNA با استفاده از Mg2+ به عنوان کوفاکتور و dNTP ها کمک می کند. اولین انتخاب برای هرگونه واکنش PCR ، آنزیم Taq پلیمراز DNA است. سرعت تکثیر پلیمراز Taq DNA بسیار زیاد است، مقاوم به دماست و حتی می تواند در دمای بالاتر کارآمد باشد. هنگامی که ما در مورد واکنش PCR استاندارد صحبت می کنیم ، Taq خوب است، اما برای همه نوع واکنش های تکثیری مناسب نیست. اگر اختصاصیت مهمترین هدف واکنش PCR شماست، از DNA پلیمراز Hot start استفاده کنید. اگر بدون خطا بودن هدف اصلی واکنش PCR شماست از DNA پلیمراز با fidelity بالا استفاده کنید. DNA پلیمراز با اتصال بالا ، DNA را تکثیر می کند و همچنین نوکلئوتیدهای ناسازگار را از رشته DNA در حال رشد خارج می کند.

برای جزئیات بیشتر، در مورد اتواع پلیمراز ها می توانید مقاله قبلی ما را بخوانید.

4. طراحی پرایمر:

آغازگر یک DNA کوتاه تک رشته ای است که برای تکثیر DNA الگو استفاده می شود. توالی آغازگر مکمل منطقه هدف DNA ما است و یک انتهای ۳ آزاد برای اضافه کردن dNTPs برای Taq DNA پلیمراز فراهم می کند. طراحی آغازگر عامل مهمی در کار آزمایشگاه PCR است. نرم افزار primer3 بهترین انتخاب برای طراحی آغازگر برای هرگونه واکنش PCR است.

آغازگر ایده آل باید دارای خصوصیات زیر باشد:

• محتوای GC بین ۵۰ تا ۵۵ درصد
• حداقل ۱۸ تا ۲۲ نوکلئوتید طول دارد
• دارای ساختار ثانویه نیست
• دمای آنیل بین ۵۰ تا ۶۵ درجه سانتی گراد

آغازگر حاوی تمام این خصوصیات قهرمان واکنش PCR ما است.

غلظت آغازگرها

استوک آغازگرها تحت غلظت های مختلفی ارائه می شود که باید تصمیم بگیریم که چه غلظتی برای واکنش PCR ما بهتر عمل می کند. اگر غلظت آغازگر بالاتر از حد مورد نظر باشد، در طول واکنش PCR دیمرهای آغازگر و تکثیرغیر اختصاصی رخ می دهد. از طرف دیگر، اگر غلظت پرایمر خیلی کم باشد، حتی نمی تواند DNA مورد علاقه ما را تکثیر کند. بنابراین، غلظت آغازگر تعیین کننده برای انجام تکثیر است.

غلظت ایده آل از آغازگر به این صورت است:

Primers	Concentration
Forward primer	۱۰pM
Reverse primer	۱۰pM

۱۰ pM برای PCR ما کافی است ، اگرچه من با ۷ pM هم تکثیر داشته ام، بدون باند های غیر اختصاصی و دیمرهای آغازگر. با این حال، غلظت پرایمر بیش از این، مشکل غیر ضروری برای واکنش PCR ایجاد می کند. با این وجود، شما باید غلظت آغازگر خود را با استفاده از دستگاه PCR گرادیانت بهینه کنید. اطلاعات بیشتر در مورد طراحی آغازگر PCR را در مقاله های ما دنبال کنید: دستورالعملهای طراحی پرایمر PCR.

5. استفاده از بافر واکنش PCR:

افزودن بافر واکنش در هر واکنش، یک روند واضح در واکنش PCR است، اما این یک عمل خوب نیست، ما برای همه PCR ها نیازی به بافر واکنش PCR نداریم. بله این درست است. در همه واکنش ها از بافر PCR استفاده نکنید، این فقط هدر دادن پول است. برای یک PCR ساده و معمولی، مواد اصلی بطور ریز کار می کنند. بافر واکنش PCR ترکیبی از مواد شیمیایی مختلف است که باعث افزایش راندمان تقویت واکنش می شود. به طور کلی ، واکنش PCR حاوی MgCl2 ، DMSO ، KCl ، (NH2) SO4 آلبومین ، بتانین و سایر مواد مخفی است. در واقع ، انعطاف پذیری را در تکثیر ایجاد می کند و بنابراین اتصالات غیر اختصاصی و دایمر آغازگر به راحتی با استفاده از بافر واکنش PCR شکل می گیرد. پس چه زمانی باید از بافر واکنش PCR استفاده کنیم؟
شما باید بدانید چه موقع از بافر PCR استفاده کنید و چگونه باید از آن استفاده کنید. بافر PCR در تکثیر قالب های طولانی تر، الگوی غنی از GC و برای الگوهای حساس مورد نیاز است. اگر DNA هدف شما خیلی طولانی است، باید از تقویت کننده های PCR برای تکثیر کارآمد آن استفاده کنید. اگر DNA الگوی PCR شما غنی از GC است، به برخی از مواد اضافی نیاز دارید تا تکثیر آن به بهترین شکل ممکن انجام شود.

با وجود این ، برای هر واکنشی شما باید حالت با جضور بافر PCR و بدون بافر PCR را بررسی کنید در صورت “خوب” بودن بدون مواد اضافی نسبت به استفاده از آن ، بهینه سازی شود. چرا باید پول و مواد شیمیایی را هدر داد؟ اگر بدون مواد اضافی کار کند؟ ما سه مقاله در مورد نحوه عملکرد انواع مختلف تقویت کننده های PCR در هنگام  PCR را پوشش داده بودیم.

لیست مقالات:

• Role of MgCl2 in PCR reaction
• Role of DMSO in PCR reaction
• Different components used in the PCR reaction buffer

 

نکته ۱: اگر از یک بافر PCR در واکنشی استفاده می کنید و برخی از باند های غیر اختصاصی و آغازگرهای اولیه را مشاهده کرده اید، دفعه بعد بدون استفاده از بافر واکنش PCR ، این واکنش را امتحان کنید. قطعاً نتایج خوبی خواهید گرفت.
نکته ۲: برای بیش از یک مجموعه آغازگر (واکنش مولتی پلکس و کنترل داخلی) باید بافر PCR را در آن گنجانید.
اطلاعات بیشتر در مورد multiplexing: Multiplex PCR.

ادامه دارد..